隱丹參酮誘導(dǎo)乳腺癌 MDA—MB—231 細(xì)胞凋亡的研究

周南陽(yáng)+趙虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。 方法 用不同濃度的隱丹參酮處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h。采用 MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度隱丹參酮對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活性、凋亡的影響。采用Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與0 μmol/L對(duì)照組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L隱丹參酮組MDA-MB-231細(xì)胞存活率顯著降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示隱丹參酮在20 μmol/L濃度時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為（6.34±0.52）%，與對(duì)照組（6.09±0.76）%相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在40 μmol/L、80 μmol/L濃度時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別是（18.74±0.65）%、（28.04±3.08）%，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且兩濃度組之間相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隱丹參酮在40 μmol/L、80 μmol/L濃度時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），同時(shí)，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)顯著增加（P<0.05）。 結(jié)論 隱丹參酮可誘導(dǎo)三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡調(diào)控基因有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 隱丹參酮；乳腺癌；MDA-MB-231細(xì)胞；凋亡

[中圖分類號(hào)] R273 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）34-0038-05

Study of cryptotanshinone inducing apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells

ZHOU Nanyang1 ZHAO Hong2

1.Department of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital， Hangzhou 310008， China； 2.Department of Breast Surgery， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310006， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of cryptotanshinone on the apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of cryptotanshinone for 24h. The effects of different concentrations of cryptotanshinone on the activity and apoptosis of MDA-MB-231 cells were detected by MTT and flow cytometry. Western blot was used to detect the protein expressions of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in MDA-MB-231 cells. Results Compared with that of the 0 μmol/L control group， the survival rates of MDA-MB-231 cells in 10， 20， 40， 80 μmol/L cryptotanshinone groups were significantly decreased（P<0.05）. And the survival rate was dose-dependent.Flow cytometry showed that the apoptosis rate of MDA-MB-231 cells was（6.34±0.52）% at cryptotanshinone concentration of 20 μmol/L， which was not significantly different from that of the control group （6.09±0.76）% （P>0.05）. The apoptosis rates of MDA-MB-231 cells were （18.74±0.65）% and （28.04±3.08）% respectively at 40 μmol/L and 80 μmol/L， which were different from those of the control group（P<0.05）， and the difference between the two concentration groups was statistically significant（P<0.05）. Western blot results showed that anti-apoptotic protein Bcl-2 expression in MDA-MB-231 cells was significantly down-regulated at cryptotanshinone concentrations of 40 μmol/L and 80 μmol/L， compared with that of the control group（P<0.05）. Meanwhile， the expression of pro-apoptotic proteins Bax and Caspase-3 increased significantly（P<0.05）. Conclusion Cryptotanshinone can induce the apoptosis of triple negative MDA-MB-231 cells， which may be related to the activation of apoptosis regulatory genes including Bax，Caspase-3 and Bcl-2.endprint

[Key words] Cryptotanshinone； Breast cancer； MDA-MB-231 cells； Apoptosis

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增加，目前居女性癌死亡率第一位[1]。其中，以雌激素、孕激素及人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）表達(dá)陰性的三陰乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）惡性程度最高，因其對(duì)內(nèi)分泌治療和抗Her-2靶向治療不敏感，故生存率比非三陰性乳腺癌差[2，3]。針對(duì)抗三陰乳腺癌的新藥研究成為目前乳腺癌治療的重點(diǎn)之一。隱丹參酮（Cryptotanshinone）是從中藥丹參根中提取分離的二萜醌類有效單體，具有抗炎、抗菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)活性和藥理效應(yīng)[4，5]。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道，隱丹參酮可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，從而發(fā)揮其抗腫瘤的作用[6，7]。目前，有關(guān)隱丹參酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。本研究以三陰乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，用不同濃度隱丹參酮干預(yù)，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活性和凋亡的影響，檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)水平，從而觀察隱丹參酮對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，并初步探究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。胎牛血清和 RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone 公司。隱丹參酮購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司（純度大于98%）（圖1），將隱丹參酮溶于 DMSO配制成等20 mmol/L的儲(chǔ)備液，分裝后于-20℃儲(chǔ)存；使用時(shí)用無(wú)血清 RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的工作液，DMSO 終濃度為 0.1%，對(duì)照組為含0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG購(gòu)自 Cell Signaling Technology公司。Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。流式抗體 Annexin V-FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞在37℃，5% CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá) 90%并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用 0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)1×104/孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng) 24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，各孔分別加入 200 μL 含有不同濃度隱丹參酮的工作液（0、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L），同時(shí)設(shè)調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，利用 MTT 法在波長(zhǎng)490 nm 處檢測(cè)各組樣品吸光度值（A490）。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%，對(duì)照組定義為100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔板，3×105/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，以不同濃度隱丹參酮（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集1×105細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide 混勻后，溫室避光孵育染色10 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細(xì)胞融合至 80% 時(shí)，以不同濃度隱丹參酮（0、40 μmol/L、80 μmol/L）處理細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入75 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取 25 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，用5% BSA/TBST封閉液室溫下封閉1 h，洗膜后加入抗Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin 一抗（1∶1 000稀釋 ），4°C孵育過(guò)夜，TBST洗膜 3 次，加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫下孵育2 h，TBST 洗膜 3 次，將化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)液A和B等體積混勻涂抹于PVDF膜上，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響

本研究用MTT法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L組MDA-MB-231細(xì)胞存活率分別為（77.07±0.83）%、（62.49±1.00）%、（49.41±0.48）%、（38.98±5.06）%。與對(duì)照組相比，各濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞活性，且呈劑量依賴（圖2）。endprint

2.2 隱丹參酮對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

本研究用Annexin V-FICT/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)隱丹參酮對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，隱丹參酮在20 μmol/L濃度時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為（6.34±0.52）%，與對(duì)照組（6.09±0.76）%相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；隱丹參酮在40 μmol/L、80 μmol/L濃度時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別是（18.74± 0.65）%，（28.04±3.08）%。與對(duì)照組（6.09±0.76）%相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明隱丹參酮濃度大于40 μmol/L時(shí)可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞遷移，且呈劑量依賴（圖3）。

2.3 隱丹參酮對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)的影響

本研究用Western blot檢測(cè)隱丹參酮對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，40 μmol/L、80 μmol/L組MDA-MB-231細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)顯著增加（P<0.05），且兩濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 4）。

3 討論

三陰性乳腺癌在臨床治療中常伴隨易耐藥、易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，是目前乳腺癌治療中的難題之一[8]。隱丹參酮是從中藥丹參根中提取分離的二萜醌類有效單體，具有抗炎、抗菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理效應(yīng)[4，5]。隨著研究的深入，其抗腫瘤的特性也得到證實(shí)[6，7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可通過(guò)下調(diào)STAT3通路抑制腎細(xì)胞癌增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。Kim EJ等[10]通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮作為一種新的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα抑制劑，對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且對(duì)正常組織沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在人肺癌裸鼠原位移植模型中，隱丹參酮能有效抑制腫瘤形成，誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)可改善機(jī)體狀況[11]。因此，隱丹參酮抗腫瘤活性具有一定的研究前景。本研究前期研究結(jié)果顯示，隱丹參酮在體外可顯著抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中c-Src和FAK 蛋白的磷酸化，下調(diào)MMP2蛋白，從而抑制其遷移和侵襲。本研究結(jié)果表明，隱丹參酮可誘導(dǎo)乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。Western blot結(jié)果表明隱丹參酮顯著抑制 MDA-MB-231細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)，初步揭示了隱丹參酮誘導(dǎo)乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受環(huán)境刺激后，在基因編程調(diào)控下產(chǎn)生的細(xì)胞自主性死亡過(guò)程[12]。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)激活或抑制凋亡相關(guān)信號(hào)通路，從而維持其不斷增殖并避免發(fā)生凋亡[12]。其中，Caspase 蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)、Bcl-2 家族抗凋亡和促凋亡蛋白表達(dá)的改變與凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[13]。Caspase-3，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”是Caspase 家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分[13]?；罨?Caspase-3可直接剪切DNA 依賴性蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶，從而影響細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)過(guò)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，維生素C和甲氨蝶呤聯(lián)合治療可激活Caspase-3抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)濃度大于40 μmol/L隱丹參酮可顯著增加MDA-MB-231細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平，且隨濃度增加作用增強(qiáng)，提示隱丹參酮可能通過(guò)激活Caspase-3誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子[16]。其中，Bcl-2是抑制凋亡作用發(fā)揮的主要蛋白，為線粒體膜的整合蛋白，其基因定位于18號(hào)染色體21區(qū)[17]。Bcl-2可通過(guò)抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子AIF等促凋亡蛋白的釋放阻止凋亡的進(jìn)程[17]。Bax是促凋亡的代表成員之一，其位于19q13.3～q13.4區(qū)[18]。Bax在接收到凋亡信號(hào)刺激被激活，移位并插入線粒體外膜后形成Bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性發(fā)揮促凋亡作用[18]。此外，Bcl-2和Bax可通過(guò)同源和異源性二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[19]。在正常情況下，Bcl-2和Bax在細(xì)胞中表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，而當(dāng)Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)時(shí)，Bax/Bax同源二聚體的大量解離，促使細(xì)胞出現(xiàn)抗凋亡作用，從而引起腫瘤的發(fā)生[19]。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2比值協(xié)同紫杉醇誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)濃度大于40 μmol/L 隱丹參酮可抑制 MDA-MB-231 細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax，上調(diào)Bax/Bcl-2比值，提示隱丹參酮促凋亡機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，破壞線粒體膜完整性而促發(fā)。

綜上所述，隱丹參酮可誘導(dǎo)三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡調(diào)控基因有關(guān)。本研究為隱丹參酮應(yīng)用于乳腺癌的治療積累了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是，有關(guān)隱丹參酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞其他凋亡調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響，其與化療藥物及靶向藥物等治療手段的配伍協(xié)同效應(yīng)，以及在動(dòng)物模型上抗癌效應(yīng)及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-09-29）endprint