酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物

高教琪，段興鵬，周雍進(jìn)

(中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)研究部，遼寧 大連 116023)

脂肪酸及其衍生物(脂肪醇、脂肪酸烷基酯和烷烴等)在能源、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。由脂肪酸衍生的生物燃料和油脂化合物能夠有效地緩解由于化石資源短缺而導(dǎo)致的能源危機[1]。與燃料乙醇相比，脂肪酸衍生的生物燃料，特別是脂肪酸烷基酯和烷烴等具有更高的能量密度、與現(xiàn)有燃料更加相似的儲藏運輸特性和燃燒性能等，目前逐漸成為汽油、柴油和航空燃料最主要的替代產(chǎn)品[2]。除此之外，游離脂肪酸還廣泛用于生產(chǎn)肥皂、表面活性劑和潤滑油等工業(yè)產(chǎn)品[3]，而脂肪醇也是目前去污劑、護(hù)膚品等化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域的主要生產(chǎn)原材料[4]。目前，脂肪酸及其衍生物主要來源于天然動植物油脂的提取。但是，隨著脂肪酸及其衍生物市場需求量的不斷增大，從天然動植物提取脂肪酸及其衍生物勢必會對動植物的生存、生物多樣性以及生態(tài)效應(yīng)造成不可逆轉(zhuǎn)的影響[5]。因此，目前亟需一種更加高效和環(huán)境友好的脂肪酸及其衍生物的生產(chǎn)模式。

紅色箭頭表示釀酒酵母特有途徑，綠色箭頭表示解脂耶氏酵母特有途徑，黑色箭頭表示二者共有途徑。ME—蘋果酸酶；ICDH—異檸檬酸脫氫酶；ACL—ATP-檸檬酸裂解酶；ACS—乙酰輔酶A合酶；ACC—乙酰輔酶A羧化酶；FAA1—脂酰輔酶A合成酶；TGL—三酰基甘油脂酶；Δ9—Δ9脫氫酶；Δ12—Δ12脫氫酶；DGA1/2—二?；视王；D(zhuǎn)移酶；LRO1—磷脂-二?；视王；D(zhuǎn)移酶；POX1-6—過氧化物酶體乙酰輔酶A氧化酶；WS/DGAT—蠟酯合成酶/乙酰輔酶A二?；视王；D(zhuǎn)移酶；AL-FAR—醇脂酰輔酶A還原酶；AH-FAR—醛脂酰輔酶A還原酶；ADO—醛去甲酰氧化酶圖1 酵母脂肪酸及其衍生物代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of fatty acid-derived chemicals in yeasts cells

利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)諸多天然產(chǎn)物是一種可再生且環(huán)境友好的生產(chǎn)模式，近年來受到廣泛關(guān)注。隨著代謝工程與合成生物學(xué)技術(shù)的不斷完善，利用分子生物學(xué)等手段，對微生物原始代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化并組裝外源代謝途徑，而構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠成為生產(chǎn)多種天然產(chǎn)物的有效替代手段[6]。其中，大腸桿菌(Escherichiacoli)是目前最常見的細(xì)胞工廠，具有諸多優(yōu)勢，例如較快的生長和代謝速率、兼性厭氧的生長條件以及完善的基因操作平臺等，是一種優(yōu)良的工業(yè)微生物菌株[7]。同時，大腸桿菌細(xì)胞工廠在生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物等領(lǐng)域(例如脂肪酸、高級醇和烷烴[8-9])均取得了重要進(jìn)展。

盡管酵母細(xì)胞工廠能夠?qū)崿F(xiàn)脂肪酸及其衍生物合成，但是如何提高其產(chǎn)量，使其達(dá)到甚至超過大腸桿菌細(xì)胞工廠的產(chǎn)量，并最終實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，這是國內(nèi)外一直以來的研究重點[15-16]。因此，本文主要綜述近年來利用酵母細(xì)胞工廠發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物的研究進(jìn)展，介紹了釀酒酵母、解脂耶氏酵母和圓紅冬孢酵母在脂肪酸及其衍生物生產(chǎn)等方面的應(yīng)用；在此基礎(chǔ)上，提出了提高酵母產(chǎn)脂肪酸及其衍生物產(chǎn)量的合成生物學(xué)策略，結(jié)合現(xiàn)階段存在的機遇與挑戰(zhàn)，評述了酵母細(xì)胞工廠在脂肪酸及其衍生物生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用前景，以期為其進(jìn)一步研究和工業(yè)化進(jìn)程奠定理論基礎(chǔ)。

1 釀酒酵母：傳統(tǒng)的細(xì)胞工廠

釀酒酵母具備完善的基因操作平臺，成為除大腸桿菌以外研究最為廣泛的生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物的細(xì)胞工廠。野生型釀酒酵母脂肪酸合成途徑如圖1所示。概括來說，糖類化合物經(jīng)糖酵解過程生成的丙酮酸在丙酮酸脫氫酶或丙酮酸脫氫酶旁路的作用下生成乙酰輔酶A，隨后在乙酰輔酶A羧化酶催化下與CO2發(fā)生羧化反應(yīng)形成丙二酰輔酶A，最后利用脂肪酸合酶經(jīng)過多輪反應(yīng)實現(xiàn)碳鏈的逐漸延長，形成含有16～18個碳的脂酰輔酶A。脂酰輔酶A是生成脂肪酸、脂肪酸酯(油脂)、脂肪醇以及烷烴的前體物質(zhì)。由于缺少Δ12脫氫酶的編碼基因，釀酒酵母只能依靠自身Δ9脫氫酶形成單不飽和脂肪酸及衍生物[17]。盡管野生型釀酒酵母能夠?qū)崿F(xiàn)脂肪酸及其衍生物的合成，但合成效率很低，無法滿足產(chǎn)物積累及生產(chǎn)需求。因此，近年來，借助代謝途徑的改造和優(yōu)化，結(jié)合合成生物學(xué)策略，釀酒酵母細(xì)胞工廠在脂肪酸及其衍生物生產(chǎn)領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展(表1)。

1.1 釀酒酵母產(chǎn)脂肪酸

脂肪酸或者脂酰輔酶A是后續(xù)脂肪醇和烷烴合成的前體。因此，借助代謝工程改造，增加脂肪酸或者脂酰輔酶A的產(chǎn)量至關(guān)重要。

首先，通過引入ATP-檸檬酸裂解酶途徑，提高前體物質(zhì)乙酰輔酶A供應(yīng)。野生型釀酒酵母主要有兩條乙酰輔酶A合成途徑：胞漿中的丙酮酸脫羧途徑和線粒體中的丙酮酸脫氫。胞漿中的丙酮酸脫羧途徑碳代謝流主要流向了乙醇，而線粒體中大部分的乙酰輔酶A直接進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)[18]，因此，在胞漿中脂肪酸的合成過程中，前體物質(zhì)乙酰輔酶A的量明顯不足。在產(chǎn)油酵母中，乙酰輔酶A的來源有另外一條途徑：ATP-檸檬酸裂解酶途徑，也就是說，進(jìn)入TCA循環(huán)的檸檬酸可以在特定情況下轉(zhuǎn)運到胞漿中，之后在ATP-檸檬酸裂解酶的作用下生成草酰乙酸和乙酰輔酶A(圖1)，同時，這一過程伴隨著ATP的消耗。Zhou等[16]和Tang等[19]的研究結(jié)果提供了以提高前體物質(zhì)乙酰輔酶A供應(yīng)的角度增加脂肪酸合成的代謝工程策略。異源ATP-檸檬酸裂解酶基因主要來自家鼠(Musmusculus)[16,19]和產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母[12]，且該基因在釀酒酵母中能夠表達(dá)和行使功能，為脂肪酸及其衍生物的生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)。

其次，對脂肪酸合成途徑關(guān)鍵代謝基因進(jìn)行優(yōu)化。對釀酒酵母脂肪酸及其衍生物合成途徑中關(guān)鍵基因的優(yōu)化能夠促進(jìn)乙酰輔酶A前體到終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化過程，具體見圖2。首先是乙酰輔酶A羧化酶(由ACC1基因編碼)。脂肪酸合成起始于乙酰輔酶A與丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，該羧化反應(yīng)由乙酰輔酶A羧化酶催化完成，是脂肪酸合成過程的重要步驟。因此，ACC1基因表達(dá)的優(yōu)化至關(guān)重要。釀酒酵母含有內(nèi)源的ACC1基因，所以很多研究都選擇將這一內(nèi)源基因進(jìn)行過表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪酸合成的啟動強度[16,20-23]；其次是脂肪酸合酶(FAS)。脂肪酸合成的第2個步驟是在FAS作用下乙酰輔酶A與丙二酰輔酶A的酶促反應(yīng)。FAS是一個復(fù)雜的復(fù)合酶系，在酵母中含有6個酶活性中心和1個?；d體功能域ACP，并定位于2個多功能肽鏈(FAS1和FAS2)。因此，對FAS的優(yōu)化過程也相對復(fù)雜，包括對其來源[16,20-21]以及結(jié)構(gòu)[24-25]的雙重優(yōu)化。FAS酶活力的提高能夠促進(jìn)脂肪酸的合成，甚至在其結(jié)構(gòu)上的改造能夠控制脂肪酸的碳鏈長度[24-26]；另外，對脂肪酸碳鏈延長系統(tǒng)的修飾能獲得超長鏈脂肪酸衍生物[21]。

最后，逆反應(yīng)途徑或競爭途徑基因敲除也能夠使產(chǎn)物積累達(dá)到最大化。脂肪酸生成的逆反應(yīng)包括脂肪醛形成脂肪酸(由醛脫氫酶HFD1催化)[11，16,22,27]，脂肪酸到脂酰輔酶A(由脂酰輔酶A合成酶FAA1和FAA4催化)[16,20,23,28-30]以及脂酰輔酶A形成乙酰輔酶A(由脂酰輔酶A氧化酶POX1催化)[16,27](圖2)。因此，這些逆反應(yīng)途徑或競爭途徑中關(guān)鍵酶的敲除能夠顯著增加脂肪酸以及脂酰輔酶A等的積累，獲得脂肪酸及其衍生物的高產(chǎn)菌株。

在釀酒酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)脂肪酸方面，通過整合上述部分策略進(jìn)行了代謝途徑改造，雖然能夠?qū)崿F(xiàn)脂肪酸的積累，但是產(chǎn)量相對較低，搖瓶發(fā)酵水平普遍在0.5 g/L以下。因此，Zhou等[16]整合了相對全面的代謝途徑改造策略，在此基礎(chǔ)上對關(guān)鍵基因的來源及表達(dá)強度進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，使搖瓶水平上的脂肪酸產(chǎn)量超過1.0 g/L，批式補料發(fā)酵甚至達(dá)到了10.4 g/L，是近年來報道的最為理想的發(fā)酵結(jié)果之一。除此之外，過表達(dá)FAS系統(tǒng)中與脂肪酸碳鏈延長相關(guān)基因ScfabF，能夠提高脂肪酸產(chǎn)量至0.85 g/L左右[31]。同時，增強β-氧化途徑的逆反應(yīng)過程也為脂肪酸產(chǎn)量的提高提供了新的策略[32]。

首先，為企業(yè)培養(yǎng)動手能力強、綜合素質(zhì)高的技能型人才是本專業(yè)辦學(xué)的目標(biāo)，因此學(xué)院建立了由酒店高管、行業(yè)領(lǐng)軍人才、骨干教師等參與的專業(yè)建設(shè)指導(dǎo)委員會。每年對酒店市場的需求及行業(yè)的變化進(jìn)行相關(guān)調(diào)研，根據(jù)調(diào)研情況編制和調(diào)整基于雙證融通的合理化培育英才的計劃和措施，重點關(guān)注學(xué)生職業(yè)素養(yǎng)、服務(wù)意識、團(tuán)隊協(xié)作等方面的能力提升。逐步形成了酒店企業(yè)技能標(biāo)準(zhǔn)、酒店前廳部客房部技能、餐飲服務(wù)技能等專業(yè)教學(xué)和職業(yè)技能標(biāo)準(zhǔn)的“雙證融通課程”。

1.2 釀酒酵母產(chǎn)脂肪醇

釀酒酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)脂肪醇的途徑主要有兩條(圖2)。一是由脂酰輔酶A在FAR的催化下直接合成脂肪醇，二是脂肪酸利用羧酸還原酶(CAR)、乙醇脫氫酶(ADH)或乙醛還原酶(ALR)，經(jīng)由脂肪醛形成脂肪醇。由于高等動植物具備天然合成脂肪醇的能力，目前這些脂肪醇合成基因主要來自于這些高等動植物，如擬南芥、鳥類等，并且能夠在釀酒酵母中實現(xiàn)脂肪醇的生產(chǎn)[11，20-22,33]。脂肪醛作為脂肪醇和烷烴的前體化合物，還可以經(jīng)脂肪酸還原得來。目前來源于海魚分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)的car基因能夠有效地提高脂肪酸的轉(zhuǎn)化，并更有利于脂肪醇和烷烴的合成[16,27]。同時，油脂(TAGs)的合成是前體物質(zhì)脂酰輔酶A積累的最大競爭途徑(圖1)，因此，通過敲除TAGs合成途徑中的關(guān)鍵酶DGA1，可以減少脂酰輔酶A的消耗，增加產(chǎn)物的積累[22,33]。

但是，目前酵母脂肪醇的產(chǎn)量明顯低于脂肪酸，普遍在0.1 g/L左右(表1)。但是，F(xiàn)eng等[12]認(rèn)為脂肪醇的積累可能與細(xì)胞內(nèi)的磷脂代謝相關(guān)，并通過敲除相關(guān)基因，首次將酵母脂肪醇產(chǎn)量提高到0.33 g/L，批式補料條件下達(dá)到1.1 g/L。最近，D′espaux等[22]通過整合多種合成生物學(xué)策略，成功將酵母脂肪醇搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量提高到1 g/L以上，并在批式補料條件下達(dá)到6 g/L，基本與脂肪酸產(chǎn)量相當(dāng)。

1.3 釀酒酵母產(chǎn)烷烴

烷烴作為航空燃料的重要組成部分，提高其產(chǎn)量至關(guān)重要[34]。最普遍的烷烴合成途徑主要依靠脂肪酸或脂酰輔酶A還原和脫羧作用，經(jīng)由脂肪醛最終形成烷烴(圖1)。在酵母中實現(xiàn)烷烴的生產(chǎn)需在高產(chǎn)脂肪酸菌株的基礎(chǔ)上表達(dá)脂肪醛去甲酰氧化酶，因此，其組分通常為含有13、15和17個碳的烷烴(表1)。同時，在酵母中表達(dá)某些高等植物來源的烷基合成酶能夠?qū)崿F(xiàn)超長碳鏈烷烴的生產(chǎn)[35]。盡管如此，目前酵母細(xì)胞工廠的烷烴生產(chǎn)過程還處于初步階段，產(chǎn)量基本在毫克級別，若完成酵母產(chǎn)烷烴的工業(yè)化生產(chǎn)還需更多理論研究支持。

CL—ATP-檸檬酸裂解酶；ACC1—乙酰輔酶A羧化酶；FAS—脂肪酸合成酶；POX1—過氧化物酶體乙酰輔酶A氧化酶； FAR—脂酰輔酶A還原酶；FAA1/4—脂酰輔酶A合成酶；’tesA—硫酯酶；HFD1—醛脫氫酶；AAR—脂酰ACP/CoA還原酶；ALR—醛還原酶；ADH—醇脫氫酶圖2 釀酒酵母細(xì)胞工廠構(gòu)建策略提高脂肪酸及其衍生物產(chǎn)量Fig.2 Enhancement of fatty acid-derived chemicals production by engineered cell factories of S. cerevisiae

表1 釀酒酵母細(xì)胞工廠產(chǎn)脂肪酸、脂肪醇和烷烴

注：a—分號前基因為過表達(dá)(大寫)，分號后基因為敲除(小寫)；b—MM為基本培養(yǎng)基，YPD為復(fù)合培養(yǎng)基；c—以1 g細(xì)胞干質(zhì)量計；d—以O(shè)D600時測的生物量為參照。

2 解脂耶氏酵母：新興的產(chǎn)油細(xì)胞工廠

作為一種新型的非傳統(tǒng)酵母，解脂耶氏酵母廣泛存在于含有疏水介質(zhì)的環(huán)境中。由于其較高的安全性(GRAS)，解脂耶氏酵母被廣泛應(yīng)用于食品和藥物等生產(chǎn)過程[36]。與釀酒酵母不同，解脂耶氏酵母作為一種產(chǎn)油酵母而被廣泛關(guān)注。解脂耶氏酵母油脂含量甚至能夠超過其自身細(xì)胞干質(zhì)量的50%以上。因此，作為細(xì)胞工廠，解脂耶氏酵母在生產(chǎn)脂肪酸、脂肪醇和烷烴等油脂類生物燃料和化合物方面具有更加突出的優(yōu)勢。近年來，隨著代謝工程和合成生物學(xué)研究工作的不斷深入[37]，使人為改造解脂耶氏酵母的代謝途徑以及關(guān)鍵基因成為可能，并取得了重大突破。作為新型的產(chǎn)油細(xì)胞工廠，在油脂、脂肪醇和烷烴生產(chǎn)領(lǐng)域解脂耶氏酵母正逐步成為國內(nèi)外的研究熱點。

2.1 解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪酸及油脂

作為產(chǎn)油酵母，解脂耶氏酵母生產(chǎn)脂肪酸或者油脂是最為重要的應(yīng)用方向。解脂耶氏酵母脂肪酸和油脂的合成途徑如圖1所示。其中，脂肪酸的合成途徑與釀酒酵母類似，均是以乙酰輔酶A為前體化合物，通過乙酰輔酶A羧化酶(ACC1,YALI0C11407g)[38]和脂肪酸合酶(FAS,YALI0B15059g和YALI0B19382g)[39]的催化形成脂酰輔酶A，區(qū)別是在產(chǎn)油酵母存在特有的乙酰輔酶A合成途徑(ATP-檸檬酸裂解酶,ACL,YALI0E34793g和YALI0D24431g)[39]。除此之外，解脂耶氏酵母和釀酒酵母在脂肪酸合成方面的差異主要表現(xiàn)在還原力(NADPH)來源以及脂肪酸的合成種類等[17]上面。

解脂耶氏酵母油脂的合成是在脂肪酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行的酯化反應(yīng)(圖1)，合成的油脂主要儲存在脂質(zhì)體中，其中三酰基甘油(TAG)占85%，甾醇酯(SE)占8%。主要的TAGs合成有兩條途徑：一是二?；视?來源于CDP-DAG途徑)在LR01(lro1基因)(YALI0E16797g)作用下的磷脂化反應(yīng)，該過程主要發(fā)生在菌體的對數(shù)生長期；二是以脂酰輔酶A為前體物質(zhì)，經(jīng)過DGA1(YALI0E32769g)和DGA2(YALI0D07986g)合成TAGs，主要發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期(圖1)。

野生型的解脂耶氏酵母能夠有效地積累油脂，通過發(fā)酵條件和培養(yǎng)方式的優(yōu)化，油脂含量能夠達(dá)到40%左右[40]。為了進(jìn)一步優(yōu)化解脂耶氏酵母油脂合成過程，經(jīng)過改造的工程菌株展現(xiàn)了更強的油脂積累性能。研究表明，過表達(dá)dga1和dga2能夠顯著提高油脂積累量[41]，而gut2[42]、pox1-6[42]和yal1[43]等基因的敲除也有利于解脂耶氏酵母油脂的積累(表2)。Qiao等[15]通過改變還原力NADPH和前體物質(zhì)乙酰輔酶A的供應(yīng)，有效地將油脂產(chǎn)量提高到98.9 g/L以上，占到細(xì)胞干質(zhì)量的70%，是目前為止最理想的結(jié)果。有趣的是，通過改變脂肪酸合酶(FAS)的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象，能夠有效地改變油脂中不同游離脂肪酸種類之間的比例，特別是控制中長鏈脂肪酸的產(chǎn)量[44]。

2.2 解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪醇

與釀酒酵母相似，解脂耶氏酵母脂肪醇的生產(chǎn)主要是以脂酰輔酶A為前體，在脂酰輔酶A還原酶(FAR)的催化作用下完成(圖1)。因此，目前對解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪醇的研究也主要集中在對FAR基因的優(yōu)化(來源和表達(dá)強度)[13-14，45]。Wang等[14]通過引入來源于貓頭鷹的FAR基因(Tafar1)實現(xiàn)了解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪醇，并通過優(yōu)化Tafar1表達(dá)強度，發(fā)現(xiàn)包含5個拷貝Tafar1的菌株，其脂肪醇產(chǎn)量提高63倍以上，但其中90%以上脂肪醇存在于胞內(nèi)；而通過在發(fā)酵過程中添加正癸烷相，能夠有效地將解脂耶氏酵母胞內(nèi)脂肪醇萃取到胞外，并最終提純到正癸烷相，回收率在90%以上，提供了一種有效的產(chǎn)物和菌體的分離手段，有利于產(chǎn)量提高[45]；但是，單純通過FAR基因優(yōu)化很難實現(xiàn)高產(chǎn)脂肪醇的目的。因此，敲除競爭反應(yīng)相關(guān)基因以及增加前體供應(yīng)均能夠顯著提高解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪醇的能力，其中以敲除油脂生成途徑基因dga1[14]和β-氧化途徑相關(guān)基因pex10[13]效果最為明顯。

由于解脂耶氏酵母能夠天然利用多種疏水性底物，特別是脂肪醇和烷烴，因此，為了提高脂肪醇的產(chǎn)量，避免其自身的消耗至關(guān)重要。有研究表明，乙醇脫氫酶ADH1-7和脂肪醇氧化酶FAO1均與解脂耶氏酵母的脂肪醇代謝相關(guān)，其中ADH1、ADH3和FAO1發(fā)揮主要作用。敲除突變菌在以烷烴為底物時能夠積累更多的脂肪醇類?？傊岣咧敬己铣苫騀AR表達(dá)量、降低競爭途徑對前體脂酰輔酶A的消耗以及敲除脂肪醇的代謝途徑相關(guān)基因等策略均能夠促進(jìn)解脂耶氏酵母脂肪醇生產(chǎn)能力，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2.3 解脂耶氏酵母產(chǎn)烷烴

由于其較強的天然烷烴代謝能力，解脂耶氏酵母并不是一個理想的烷烴合成工廠。解脂耶氏酵母基因組中含有12個烷烴代謝的相關(guān)基因，不同的碳鏈長度具有不同的特異性[34]。但是，借助適當(dāng)?shù)拇x工程與合成生物學(xué)策略，Blazeck等[46]首先在解脂耶氏酵母中實現(xiàn)了戊烷的生產(chǎn)。區(qū)別于常規(guī)烷烴合成途徑，一種大豆來源的脂肪氧合酶(Gmlox1)能夠?qū)営退徂D(zhuǎn)化為戊烷并通過進(jìn)一步的優(yōu)化和β-氧化途徑阻斷(mfe1基因敲除)，實現(xiàn)了解脂耶氏酵母積累烷烴的目的，產(chǎn)量達(dá)到4.98 mg/L[46]。最近，通過過表達(dá)海魚分枝桿菌來源的羧酸還原酶(MmCAR)、梭狀芽孢桿菌來源的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(BsuSfp)以及原綠球藻來源的醛去甲酰氧化酶(PmADO)，烷烴的產(chǎn)量提高到23.3 mg/L，但由于較強的β-氧化作用，十三烷在產(chǎn)物組成中占有較高比例[47]。隨著代謝途徑研究的不斷深入[48-50]，解脂耶氏酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)烷烴類化合物終將取得令人滿意的結(jié)果。

3 產(chǎn)油酵母：圓紅冬孢酵母

生物柴油能夠有效地緩解由于化石資源短缺而導(dǎo)致的全球范圍內(nèi)的能源危機，而其主要來源于油脂的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)(脂肪酸甲基酯和脂肪酸乙基酯等)。除了上述的解脂耶氏酵母，圓紅冬孢酵母是另一種極具發(fā)展前景的產(chǎn)油酵母類型。與解脂耶氏酵母相比，圓紅冬孢酵母能夠利用葡萄糖積累更高含量的油脂[51]，而且能夠天然利用包括木糖和纖維二糖在內(nèi)的多種糖類[52]。因此，圓紅冬孢酵母具有廣泛的工業(yè)化應(yīng)用前景，近年來也受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。作為油脂生產(chǎn)菌種，圓紅冬孢酵母能夠在搖瓶發(fā)酵水平上積累0.436 g油脂(以1 g細(xì)胞干質(zhì)量計)，在發(fā)酵罐水平上積累0.535 g油脂，其中油脂組成包含35%飽和脂肪酸、46%的單不飽和脂肪酸以及其余的多不飽和脂肪酸[53]。

與解脂耶氏酵母相比，圓紅冬孢酵母的基因工程改造的難度更大，但是借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)圓紅冬孢酵母產(chǎn)油途徑的代謝工程改造過程[54-55]。通過過表達(dá)圓紅冬孢酵母自身的乙酰輔酶A(由ACC1編碼)和二?；视王；D(zhuǎn)移酶(由dga1編碼)，油脂的積累量達(dá)到0.612 g(以1 g細(xì)胞干質(zhì)量計)[54]。在此基礎(chǔ)上，通過過表達(dá)硬脂酰輔酶A脫氫酶，進(jìn)一步提高了油脂的生產(chǎn)強度，并使其批式補料條件下的產(chǎn)量達(dá)到0.755 g(以1 g細(xì)胞干質(zhì)量計)[55]。

中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員課題組長期以來一直致力于圓紅冬孢酵母產(chǎn)油過程的相關(guān)研究。從培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件優(yōu)化[56-58]，到圓紅冬孢酵母的基因工程改造[59]以及后續(xù)的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)[60]，均進(jìn)行了大量的深入研究，為以圓紅冬孢酵母為底盤微生物進(jìn)行油脂發(fā)酵的工業(yè)化進(jìn)程奠定了重要基礎(chǔ)。值得一提的是，早在2013年，趙宗保研究員的課題組就開展了圓紅冬孢酵母多組學(xué)的測序研究工作，為其后續(xù)的基因工程改造提供了良好的理論支持[61]。同時，盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法能夠?qū)崿F(xiàn)圓紅冬孢酵母的基因工程改造，但其耗時、耗力，不利于合成生物學(xué)策略的開展。因此，他們提出了一種改良的電轉(zhuǎn)化方法，在保證高轉(zhuǎn)化效率的前提下，極大地降低了操作難度，加快了實驗進(jìn)程[62]，為圓紅冬孢酵母后續(xù)的復(fù)雜合成生物學(xué)改造過程奠定了良好基礎(chǔ)。

4 合成生物學(xué)策略提高酵母脂肪酸及其衍生物產(chǎn)量

4.1 提高前體物質(zhì)供應(yīng)

乙酰輔酶A是脂肪酸合成的起始，也是整個過程的重要前體物質(zhì)。因此，提高乙酰輔酶A供應(yīng)量能夠有效地提高脂肪酸產(chǎn)量。野生型釀酒酵母的乙酰輔酶A生物合成途徑如圖1和圖2所示，由于ACS基因反饋抑制以及較高的能量消耗，乙酰輔酶的合成成為脂肪酸合成過程的限速步驟，也直接影響了其產(chǎn)量。采用合成生物學(xué)策略及技術(shù)提高乙酰輔酶A供應(yīng)實施方式如表3所示，一方面重構(gòu)酵母細(xì)胞代謝流，減少乙醇和甘油生成途徑的代謝通量，提高乙酰輔酶A生物合成流量；另一方面，異源表達(dá)乙酰輔酶A生物合成途徑，增強乙酰輔酶產(chǎn)量、削弱ACS的反饋抑制作用以及減少乙酰輔酶A生物合成過程ATP的消耗等[63]。

4.2 輔因子平衡

酵母細(xì)胞中，脂肪酸、脂類和氨基酸的合成過程需要消耗大量的還原力，特別是脂肪酸的合成，每延長兩分子碳鏈需要消耗兩分子的還原力，這主要由輔因子NADPH提供[64]。為了維持細(xì)胞內(nèi)輔因子的平衡，維持細(xì)胞生長，需要為酵母細(xì)胞提供充足的還原力。酵母細(xì)胞主要依靠氧化磷酸化和異檸檬酸的氧化(idp2和idp3)來生成基本的NADPH。但是，如果從提高脂肪酸及其衍生物產(chǎn)量的角度看，還需要進(jìn)一步提高NADPH供應(yīng)。目前提高釀酒酵母細(xì)胞NADPH供應(yīng)的策略主要是異源表達(dá)相關(guān)代謝途徑，包括來源于芽孢桿菌的3-磷酸甘油醛脫氫酶[65]、來源于克魯維酵母(Kluyveromycessp.)的3-磷酸甘油醛脫氫酶[66]以及來源于圓紅冬孢酵母(Rhodospuridiumtoruloides)和高山被孢霉(Mortierellaalpina)的蘋果酸酶[16,20]，它們均能夠通過提高細(xì)胞內(nèi)NADPH供應(yīng)提高相應(yīng)的產(chǎn)物生產(chǎn)能力。但是，由于NADPH的生成及消耗途徑的復(fù)雜性，可能還需要更多新策略以提高產(chǎn)量(表3和圖3)。

4.3 脂肪醇和烷烴生產(chǎn)的代謝途徑調(diào)控

代謝途徑構(gòu)建及優(yōu)化需要考慮代謝途徑本身以及與細(xì)胞內(nèi)代謝平衡，最終實現(xiàn)產(chǎn)量的最大化。該策略已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注并應(yīng)用于脂肪酸衍生物的合成(表3)。

脂肪酸及其衍生物，特別是烷烴，對細(xì)胞有較大的毒害作用，影響細(xì)胞生長[63]。通過某些誘導(dǎo)性啟動子，在細(xì)胞生長到一定階段后啟動產(chǎn)物的合成基因，能夠顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物的生成[21]。除了與細(xì)胞生長相關(guān)，動態(tài)調(diào)控的另一個層面主要涉及基因表達(dá)量的動態(tài)調(diào)控，細(xì)胞根據(jù)需要調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)強度，從而提高產(chǎn)物濃度。Verho等[65]和Teo等[66-67]成功將細(xì)菌中的基因調(diào)控系統(tǒng)，如FadR和AND-Gate等，應(yīng)用于釀酒酵母細(xì)胞，結(jié)合合成啟動子，成功實現(xiàn)基因表達(dá)過程的動態(tài)調(diào)控，有望應(yīng)用于脂肪酸及其衍生物的合成。

脂肪醇和烷烴的生產(chǎn)過程主要在胞漿中完成，二者之間存在競爭反應(yīng)。因此，選擇利用細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)將合成途徑封閉起來是一種有效的合成生物學(xué)策略。盡管線粒體是目前研究最為廣泛的代謝途徑區(qū)域化的亞細(xì)胞器[68]，但是過強的醛還原酶或醇脫氫酶(ALR/ADH)基因表達(dá)不適合烷烴的生產(chǎn)，而過氧化物酶體由于其不含有ALR/ADH，并且含有提供NADPH的異檸檬酸脫氫酶IDH3[69]，成為烷烴的理想合成場所，烷烴產(chǎn)量提高了1倍，通過提高過氧化物酶體數(shù)量，烷烴產(chǎn)量進(jìn)一步提高了3倍[70]。該策略還進(jìn)一步用于端位烯烴和脂肪醇的合成[70-71]，表明了該策略具有通用性。

表3 合成生物學(xué)策略提高酵母脂肪酸及其衍生物產(chǎn)量

5 結(jié)論

以脂肪酸、脂肪醇和烷烴為代表的先進(jìn)燃料對于緩解能源危機、促進(jìn)人類的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。除此之外，脂肪酸及其衍生物在表面活性劑、去污劑以及化妝品的生產(chǎn)方面也具有廣泛應(yīng)用前景。從生物多樣性以及生態(tài)效應(yīng)的角度出發(fā)，以微生物發(fā)酵來生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物是一種可再生且環(huán)境友好型的生產(chǎn)模式。隨著研究的不斷深入以及技術(shù)的日益成熟，酵母細(xì)胞工廠正成為繼大腸桿菌后的新型脂肪酸及其衍生物的高效生產(chǎn)平臺。

從釀酒酵母出發(fā)，通過引入異源ATP-檸檬酸裂解酶途徑、優(yōu)化關(guān)鍵代謝基因以及敲除競爭途徑的相關(guān)基因等，成功實現(xiàn)了釀酒酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)脂肪酸、脂肪醇和烷烴。特別是脂肪酸和脂肪醇，其搖瓶水平上的產(chǎn)量已經(jīng)突破克級，批式補料條件能夠進(jìn)一步提升其產(chǎn)量，極大推進(jìn)了其工業(yè)化進(jìn)程；而從解脂耶氏酵母出發(fā)，充分利用其產(chǎn)油酵母的特性，結(jié)合代謝工程以及合成生物學(xué)的改造，使其油脂含量得到進(jìn)一步提升，并實現(xiàn)了脂肪酸和脂肪醇的生產(chǎn)過程。同時，解脂耶氏酵母獨特的脂肪酸代謝途徑也為今后的基礎(chǔ)研究打下了堅實的理論基礎(chǔ)。

在此基礎(chǔ)上，隨著合成生物學(xué)領(lǐng)域相關(guān)策略與技術(shù)的蓬勃發(fā)展，通過提高前體物質(zhì)供應(yīng)、輔因子平衡以及代謝調(diào)控策略能夠?qū)⒔湍钢舅峒捌溲苌锏漠a(chǎn)量進(jìn)一步提高，為今后實現(xiàn)酵母細(xì)胞工廠產(chǎn)脂肪酸及其衍生物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的理論基礎(chǔ)和實踐方向。

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