釀酒酵母發(fā)酵高濃度乳清粉生產(chǎn)燃料乙醇

孫 葉，鄭兆娟，徐明月，歐陽嘉

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

乳清是牛奶奶酪加工過程中的一種副產(chǎn)物，存在于牛奶酪蛋白凝固過程中的水相里，占牛奶體積的85%～95%。乳清富含乳糖(45～50 g/L)、可溶性蛋白質(zhì)(6～8 g/L)、脂質(zhì)(4～5 g/L)、礦物鹽(80～100 g/L)等，含有55%的牛奶營養(yǎng)[1]。由于處理乳清的生化需氧量(BOD)為27～60 g/L，化學(xué)需氧量(COD)為50～102 g/L，因此，乳清被認(rèn)為是一種嚴(yán)重的環(huán)境污染物[2]。世界年產(chǎn)乳清約9×107t，其中50%被當(dāng)作廢水排放，這不僅浪費資源，更污染環(huán)境。為了使大量工業(yè)盈余的乳清變廢為寶，研究者利用乳清水解物生產(chǎn)乳清飲料、糖漿以及食品添加劑等化學(xué)品[3]。此外，乳清水解物還可以用于生產(chǎn)燃料乙醇，此研究近年來受到研究者的廣泛關(guān)注。乳清粉是乳清濃縮干燥的產(chǎn)物，相對于乳清來說，乳清粉營養(yǎng)物質(zhì)濃度高、可以長期穩(wěn)定放置、乙醇得率高、后續(xù)分離成本低，是一種更好的乙醇生產(chǎn)原料[4]。

目前，以乳清粉為原料發(fā)酵制備乙醇的菌種一般為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)[5-6]和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[7-8]，其中，釀酒酵母是一種乙醇生產(chǎn)的傳統(tǒng)菌株，但它不能直接利用乳糖，需要先將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。利用釀酒酵母發(fā)酵乳清生產(chǎn)乙醇的方式有分步糖化發(fā)酵(SHF)和同步糖化發(fā)酵(SSF)。SHF可以分別控制乳糖水解和乙醇發(fā)酵的工藝條件，使得水解和發(fā)酵過程都在最適條件下進(jìn)行。SSF可以使乳糖水解生成的單糖被及時發(fā)酵為乙醇，在發(fā)酵過程中單糖不積累，可避免底物抑制現(xiàn)象出現(xiàn)。此外，SSF中較低的葡萄糖濃度可有效避免雜菌污染，而且可以加速體系中其他糖的利用[9-11]。

本文中，筆者分別研究釀酒酵母利用高濃度乳清粉分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵制備乙醇的工藝條件，以期獲得更高的乙醇產(chǎn)量和產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料

乳糖、葡萄糖、半乳糖、β-半乳糖苷酶，Sigma公司；乳清粉(其中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69.0%，pH 6.4)，安徽工藝貿(mào)易進(jìn)出口有限公司。

其他生化試劑為進(jìn)口產(chǎn)品或國產(chǎn)市售分析純產(chǎn)品。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

釀酒酵母NL22于4 ℃保存在葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，保存于南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所。

葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母汁3，瓊脂粉15；自然pH。

活化和增殖培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖或半乳糖20，蛋白胨5，酵母汁3；自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：純糖發(fā)酵實驗的培養(yǎng)基中，加不同濃度的葡萄糖和半乳糖，額外補加營養(yǎng)鹽至如下終質(zhì)量濃度((NH4)2SO41.2 g/L，MgSO40.4 g/L，ZnCl20.4 g/L，CaCl21 g/L)；SHF實驗的培養(yǎng)基中，添加不同濃度乳糖的乳清粉在pH 6.0、60 ℃條件下酶解14 h后的酶解液；SSF實驗的培養(yǎng)基中為添加不同濃度乳糖的乳清粉水溶液，其初始pH為6.0(SSF 實驗中pH優(yōu)化除外)。

1.3 菌種培養(yǎng)方法

1.3.1 活化培養(yǎng)

將菌種從葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基接種至裝有50 mL活化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 增殖培養(yǎng)

將活化培養(yǎng)液接種至裝有100 mL增殖培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))，在30 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將增殖后的增殖培養(yǎng)液于6 000 r/min離心10 min，取釀酒酵母菌泥接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，調(diào)整初始OD為5，在30 ℃、150 r/min的條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。

1.4 分析方法

乳糖、葡萄糖、半乳糖和乙醇均采用高效液相色譜(HPLC Agilent 1200，安捷倫公司)分析，外標(biāo)法測定。色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H 色譜柱(7.8 mm×300 mm)，進(jìn)樣量為10 μL，流動相為0.005 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，采用示差折光檢測器檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 活化和增殖培養(yǎng)基中碳源種類對釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖和半乳糖的影響

Escalante-chong等[12]曾報道不同的碳源誘導(dǎo)模式可以影響半乳糖(GAL)啟動子控制下的半乳糖代謝基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，為此，筆者研究了葡萄糖和半乳糖分別作為活化增殖碳源時對釀酒酵母純糖發(fā)酵的影響，結(jié)果見表1。從表1可以看出：以半乳糖作為菌種活化增殖碳源，無論發(fā)酵培養(yǎng)基為何種碳源，都不會影響碳源利用和乙醇生產(chǎn)；但以葡萄糖作為菌種活化增殖碳源，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為半乳糖時，半乳糖利用速度明顯變慢。Hahn-H?gerdal[13]和O′Leary[14]等也報道過類似實驗現(xiàn)象。在后續(xù)實驗中，全部采用半乳糖作為活化增殖培養(yǎng)基的唯一碳源，以加速發(fā)酵時葡萄糖和半乳糖的利用速度。

2.2 分步糖化發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.2.1 pH、溫度和乳糖濃度對乳清粉酶解程度的影響

配制含不同濃度乳糖的乳清粉溶液，調(diào)整溶液pH分別為4、5、6、7和8，在30～80 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行酶解，按照10 U/g乳糖加入相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶(以乳糖為底物，在37 ℃、pH 7的條件下，每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位)，監(jiān)測12 h的乳糖水解得率，結(jié)果見表2。

由表2可以看出：在pH為5～7時，乳糖酶解效果差異不大，后續(xù)選擇pH 6作為乳清粉酶解條件。當(dāng)酶解溫度為60 ℃時，乳糖酶解速度相對最快，得率最高。而溫度過高，則會導(dǎo)致β-半乳糖苷酶活力較快喪失，酶解效果不佳。隨著乳糖濃度的增大，酶解得率變化不大。當(dāng)初始乳糖的質(zhì)量濃度為200 g/L時，酶解12 h，酶解得率為94.80%。

表1 活化和增殖培養(yǎng)基碳源種類對釀酒酵母乙醇發(fā)酵的影響

表2 利用乳清粉/乳清為原料產(chǎn)乙醇

2.2.2 乳清粉酶解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇

配制乳糖質(zhì)量濃度分別為50和200 g/L的乳清粉溶液，在最優(yōu)條件下酶解14 h使水解徹底，之后接入釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中取樣測定葡萄糖、半乳糖和乙醇濃度，結(jié)果見圖1。

圖1 乳清粉酶解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程曲線Fig.1 Production of ethanol from enzymatic hydrolysates

由圖1可以看出：低濃度乳清酶解液中葡萄糖的利用速度略高于半乳糖，葡萄糖在6 h內(nèi)迅速消耗完全，而半乳糖也在12 h內(nèi)基本消耗完全。在高濃度乳清酶解液的發(fā)酵過程中，半乳糖的利用呈現(xiàn)出明顯的滯后性，只有在發(fā)酵36 h后，葡萄糖消耗殆盡了，半乳糖才開始加速消耗，最終乙醇質(zhì)量濃度為60.36 g/L，產(chǎn)率為0.72 g/(L·h)。

2.3 同步糖化發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

分步糖化發(fā)酵中，較高濃度的葡萄糖會抑制釀酒酵母對半乳糖的利用。而同步糖化發(fā)酵中，由于乳清水解和單糖發(fā)酵同時進(jìn)行，這使得發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度一直維持在相對較低的水平，有助于解除葡萄糖抑制效應(yīng)。

2.3.1 pH和溫度對同步糖化發(fā)酵的影響

基于前期研究發(fā)現(xiàn)，本研究中使用的β-半乳糖苷酶適宜pH為4～7，而釀酒酵母發(fā)酵最佳初始pH為中性偏酸，為保證酶解和發(fā)酵均能良好進(jìn)行，研究了SSF條件下不同初始pH對乙醇生產(chǎn)的影響，配制乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉溶液，β-半乳糖苷酶用量為10 U/g乳糖，同步糖化發(fā)酵36 h后所得乙醇產(chǎn)量如圖2所示。

圖2 pH對SSF的影響Fig.2 Effects of pH on SSF

由圖2可知：當(dāng)初始pH為5和6時，所產(chǎn)乙醇濃度最高。此外，SSF過程中，發(fā)酵液的pH呈逐漸下降趨勢，因此，初始pH(pH=7)略高于最適pH時，乙醇產(chǎn)量下降較少，但初始pH(pH=4)略低于最適pH時，乙醇產(chǎn)量大幅度下降?；诖?，選擇pH 6作為初始發(fā)酵pH。

對絕大多數(shù)釀酒酵母而言，良好的發(fā)酵能力一般處在25～32 ℃的溫度范圍內(nèi)，而本文中的β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃左右。本實驗采用初始乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉作為底物，β-半乳糖苷酶用量為10 U/g乳糖，分別于24、27、30、33和36 ℃下同步糖化發(fā)酵36 h，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對SSF的影響Fig.3 Effects of temperature on SSF

由圖3可以看出：在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)提高溫度對SSF過程有利。當(dāng)溫度超過30 ℃時，隨著溫度的升高，雖然β-半乳糖苷酶的活性增加，但高溫可能對釀酒酵母生長不利，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量下降較快。后續(xù)選擇30 ℃作為同步糖化發(fā)酵的控制溫度。

2.3.2 不同濃度乳清粉的同步糖化發(fā)酵

考察不同底物濃度對同步糖化發(fā)酵過程的影響。分別配制乳糖質(zhì)量濃度為50、100以及200 g/L的乳清粉溶液，按照10 U/g乳糖加入相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶，在最優(yōu)條件下發(fā)酵，發(fā)酵過程中取樣測定乳糖、葡萄糖、半乳糖和乙醇濃度，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度乳清粉的同步糖化發(fā)酵過程曲線Fig.4 Production of ethanol with different concentrations of whey power

由圖4可以看出：同步糖化發(fā)酵過程中，無論初始乳清粉加入多少，葡萄糖都不會積累，半乳糖在前6 h內(nèi)濃度上升，之后迅速下降直至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)以乳糖質(zhì)量濃度為50 g/L的乳清粉溶液為底物時，乙醇質(zhì)量濃度最高為23.46 g/L，產(chǎn)率為1.96 g/(L·h)。提高乳清粉濃度，乙醇產(chǎn)量隨之上升，但產(chǎn)率下降。當(dāng)以乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉溶液為底物時，最終乙醇質(zhì)量濃度為58.58 g/L，產(chǎn)率為1.63 g/(L·h)。在同步糖化發(fā)酵初始乳糖質(zhì)量濃度增至200 g/L時，發(fā)酵效率略有下降。一方面，發(fā)酵前期(6 h)乳糖糖化產(chǎn)生的葡萄糖及時轉(zhuǎn)化成乙醇，減少了其對乳糖水解的抑制效應(yīng)，另一方面，體系中持續(xù)低水平的葡萄糖濃度和乳糖糖化產(chǎn)生的半乳糖不斷積累可能誘導(dǎo)了半乳糖代謝相關(guān)酶的生成[12]，這兩者使得體系中的半乳糖被高效迅速地轉(zhuǎn)化。

綜上，與SHF相比，SSF大大加快了乙醇生產(chǎn)速率。在后續(xù)補料同步糖化發(fā)酵中，筆者選擇200 g/L為乳清粉乳糖的初始質(zhì)量濃度。

2.4 補料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

在工業(yè)上，高濃乙醇發(fā)酵可以大大降低乙醇蒸餾成本和提高設(shè)備利用率[15]。為進(jìn)一步提高乳清粉乙醇生產(chǎn)潛力，嘗試如下分批補料工藝。

配制乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉溶液，調(diào)整溶液pH為6，按照10 U/g乳糖加入相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶，在最適條件下發(fā)酵。發(fā)酵8 和12 h時分別補加1次終質(zhì)量濃度約100 g/L的乳清粉，同時補加相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶。發(fā)酵過程曲線如圖5所示。

圖5 補料糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇Fig.5 Production of ethanol by fed-batch SSF

由圖5可以看出：發(fā)酵體系中的葡萄糖濃度一直處于非常低的水平，半乳糖濃度隨著乳清粉添加和酶解進(jìn)行不斷升高，在20 h時半乳糖濃度達(dá)到最高值，之后快速下降。乙醇濃度在前12 h內(nèi)增加較快，之后速度放緩。發(fā)酵12 h后，乙醇質(zhì)量濃度為63.78 g/L，產(chǎn)率為5.32 g/(L·h)；發(fā)酵68 h后，乙醇質(zhì)量濃度為118.52 g/L，產(chǎn)率為1.74 g/(L·h)。補料發(fā)酵過程中，葡萄糖的發(fā)酵速率遠(yuǎn)大于酶解生成葡萄糖的速率，通過及時補料使得菌體保持在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期中進(jìn)行生長和乙醇的積累。此外，初期半乳糖的發(fā)酵速率不高，在釀酒酵母交替利用葡萄糖和半乳糖的過程中，半乳糖積累并使得酵母被馴化，逐漸加快半乳糖的利用速度。

與現(xiàn)有報道中以乳清等原料進(jìn)行乙醇生產(chǎn)的研究相比，結(jié)果見表3。由表3可知，本研究在乙醇產(chǎn)量和產(chǎn)率上都具有一定優(yōu)勢，具有良好開發(fā)運用前景。此外，與當(dāng)下文獻(xiàn)中研究較多的玉米、木薯、甘蔗和秸稈原料的燃料乙醇生產(chǎn)相比，乳清粉原料在乙醇生產(chǎn)時具有“不與人爭糧”、運輸與儲存成本相對較低、預(yù)處理方法簡單以及環(huán)境污染小等顯著優(yōu)勢。

表3 利用乳清粉/乳清為原料產(chǎn)乙醇

3 結(jié)論

1)S.cerevisiaeNL22能快速利用高濃度乳清粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，使得其在對乳清粉酶解發(fā)酵上展現(xiàn)了良好應(yīng)用前景。

2)與分步糖化發(fā)酵相比，采用同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇可明顯縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。

3)同步糖化發(fā)酵的最適pH為6，最適溫度為30 ℃，在上述條件下進(jìn)行補料同步糖化發(fā)酵，最終乙醇質(zhì)量濃度為118.52 g/L，產(chǎn)率為1.74 g/(L·h)。

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