無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的研究進(jìn)展

張 鵬，林 駿，盧 元

(1. 清華大學(xué) 化學(xué)工程系，北京 100084； 2. 中國(guó)石油大學(xué)(北京) 新能源研究院，北京 102249)

生物技術(shù)的進(jìn)步使得合成生物學(xué)家可快速可靠地改造生物體系及設(shè)計(jì)生產(chǎn)生物大分子，尤其是具備生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)大分子的設(shè)計(jì)生產(chǎn)。在過(guò)去多年合成生物學(xué)的發(fā)展中，主要以細(xì)胞為宿主對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行工程化設(shè)計(jì),但是在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行工程化是費(fèi)時(shí)和困難的。主要原因在于細(xì)胞的生長(zhǎng)及適應(yīng)性過(guò)程通常與工程設(shè)計(jì)目標(biāo)是不一致的，并且由于活細(xì)胞生命系統(tǒng)的復(fù)雜性、基因元件難以標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)胞膜的阻礙等，這大大限制了生物組件的改造[1]。這些限制使人們?cè)噲D探索新的發(fā)展方向，因而推動(dòng)發(fā)展了一項(xiàng)新的工程技術(shù)——無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)。探究歷史，最初無(wú)細(xì)胞合成的雛形和代表性工作要追溯到1961年，Nirenberg和Matthaei用無(wú)細(xì)胞合成進(jìn)行創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)，在發(fā)現(xiàn)遺傳密碼子方面發(fā)揮了重要作用[2]。而現(xiàn)在，無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的發(fā)展使得其在蛋白質(zhì)合成中顯示出巨大的作用，包括合成細(xì)胞難以表達(dá)的膜蛋白、制造高附加值的生物醫(yī)藥蛋白、非天然元件的嵌入以及高通量篩選等[3]。

無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)是以外源DNA或mRNA為模板，在體系中補(bǔ)充底物和能量物質(zhì)，在細(xì)胞抽提物提供的多種酶的作用下合成蛋白質(zhì)的體外表達(dá)系統(tǒng)(圖1)。細(xì)胞抽提物可以來(lái)自不同種類的細(xì)胞，主要包括大腸桿菌[4]、小麥胚芽細(xì)胞[5]、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞[6]和昆蟲(chóng)細(xì)胞[7]等。要特別強(qiáng)調(diào)的是，另一類以純化組分為基礎(chǔ)的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)不在此討論范圍內(nèi)。無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)以DNA或mRNA為模板，提供了靈活多變的蛋白表達(dá)方式。與傳統(tǒng)的細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)相比，無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)具有眾多優(yōu)點(diǎn)：因沒(méi)有細(xì)胞膜的阻隔，外源性的物質(zhì)可以直接加入到反應(yīng)體系中，從而對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行針對(duì)性的調(diào)控，例如促進(jìn)蛋白的折疊或進(jìn)行翻譯后修飾[8]；因不存在活細(xì)胞，該體系可用于表達(dá)在胞內(nèi)系統(tǒng)中難以表達(dá)的蛋白質(zhì)，如對(duì)細(xì)胞有毒害作用的抗菌肽[9]和離子通道蛋白[10]等，同時(shí)表達(dá)過(guò)程也不受細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響；由于其開(kāi)放性的特點(diǎn)，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)能夠與其他的高通量手段或工具相耦聯(lián)，開(kāi)發(fā)新型的高通量復(fù)合研究手段。最后，無(wú)細(xì)胞形式允許進(jìn)行篩選而不需要基因克隆步驟，從而實(shí)現(xiàn)快速的工藝/產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[11]。

圖1 無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)Fig.1 Cell-free protein synthesis systems

盡管無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)相比細(xì)胞系統(tǒng)有諸多優(yōu)勢(shì)，但在發(fā)展初期，幾個(gè)障礙因素限制了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)工程及生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域的使用。這些障礙因素包括反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短、蛋白質(zhì)生產(chǎn)率低、模板不穩(wěn)定及易降解等。此外，還有昂貴的試劑成本、反應(yīng)量小以及復(fù)雜蛋白質(zhì)的合成較為困難等因素。然而，過(guò)去十幾年的技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)解決了這些局限性，并重新優(yōu)化了無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，以滿足日益增長(zhǎng)的蛋白質(zhì)合成需求。

在本文中，筆者首先介紹不同的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，接著講述無(wú)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)系統(tǒng)的技術(shù)發(fā)展，最后重點(diǎn)介紹無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的前沿應(yīng)用。

1 無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)簡(jiǎn)介

無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)利用了微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞裂解物中的能量和蛋白質(zhì)合成所必需的催化成分來(lái)生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)。雖然任何生物體都可以提供裂解物，但最常見(jiàn)的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的裂解物是大腸桿菌、小麥胚芽、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞的抽提物。這些細(xì)胞本身的特性不同，從它們中得到的提取物必然也是不同的。因此，使用無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)生產(chǎn)生物活性蛋白質(zhì)首先要選擇合適的提取物來(lái)源。表1總結(jié)了不同來(lái)源提取物的無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)，并進(jìn)行了比較。

由表1可見(jiàn)：最常用的是原核大腸桿菌提取物系統(tǒng)。因?yàn)榈谝?，大腸桿菌可以使用廉價(jià)培養(yǎng)基培養(yǎng)，直接高壓破碎進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取物的制備簡(jiǎn)單且便宜；第二，大腸桿菌的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)在間歇反應(yīng)中能得到最高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，從數(shù)百微克/毫升到毫克/毫升，這取決于目的蛋白質(zhì)的種類。第三，大腸桿菌提取物系統(tǒng)的反應(yīng)成本最低。因?yàn)樗軌蚣せ钐崛∥镏械拇x反應(yīng)，從而促進(jìn)高水平的蛋白質(zhì)合成，避免使用昂貴的能量底物[3]。

小麥胚芽、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞提取物系統(tǒng)也是常用的真核無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。與原核大腸桿菌系統(tǒng)相比，這些真核提取物系統(tǒng)在生產(chǎn)某些復(fù)雜蛋白質(zhì)方面具有優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾[4]。然而，真核無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)提取物制備程序復(fù)雜且昂貴，在間歇反應(yīng)中蛋白質(zhì)產(chǎn)量低。

迄今為止,盡管開(kāi)發(fā)的每個(gè)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)都具有優(yōu)點(diǎn)，但必須仔細(xì)考慮產(chǎn)量、成本和翻譯后修飾之間的權(quán)衡，從而進(jìn)行系統(tǒng)的選擇。

表1 不同無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的比較

2 無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展

無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成要達(dá)到最大產(chǎn)量必須滿足一些要求，包括足夠的底物供應(yīng)、穩(wěn)態(tài)環(huán)境以及沒(méi)有抑制性副產(chǎn)物產(chǎn)生。這和生長(zhǎng)快速的完整細(xì)胞的體內(nèi)狀態(tài)特征一致。因此，優(yōu)化無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的指導(dǎo)原則是通過(guò)在體外模擬細(xì)胞質(zhì)高效的系統(tǒng)來(lái)激活生物學(xué)過(guò)程。而無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)的發(fā)展與基因表達(dá)模板、代謝調(diào)控、蛋白質(zhì)折疊及工程化研究等進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。

2.1 基因表達(dá)模板

在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，基因模板的穩(wěn)定性是制約系統(tǒng)效率提高的一個(gè)關(guān)鍵因素。在常規(guī)的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)程中，一般使用質(zhì)粒為模板，以提高整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。然而，使用質(zhì)粒為模板必須進(jìn)行分子克隆、轉(zhuǎn)化以及宿主菌培養(yǎng)、質(zhì)粒純化等繁瑣步驟。該方式僅適合于研究單個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)基因的體外表達(dá)情況，對(duì)于要求高通量篩選的研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)研究或蛋白質(zhì)分子的定向進(jìn)化研究等，以質(zhì)粒為模板的表達(dá)方式則有效率低的問(wèn)題。

以線性多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物作為模板，直接由快速PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到目的基因，可避免質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、宿主菌培養(yǎng)等步驟，簡(jiǎn)化了無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的前期準(zhǔn)備工作，具有極好的高通量潛力。然而，與質(zhì)粒模板相比，線性模板更脆弱，極易受到提取物中核酸酶的攻擊而迅速被降解，從而導(dǎo)致表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率極低，且對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)功能檢測(cè)有很大的影響。因此，基因表達(dá)模板初期的研究重心放在對(duì)菌株的基因改造上。Ahn等[12]采用敲除了編碼核酸內(nèi)切酶E基因的菌株制備無(wú)細(xì)胞抽提物，這樣大大增加了DNA模板的穩(wěn)定性。除了對(duì)菌株進(jìn)行基因改造以營(yíng)造一個(gè)缺失核酸酶的無(wú)細(xì)胞反應(yīng)環(huán)境外，調(diào)整模板自身結(jié)構(gòu)以抵御外界核酸酶攻擊則可能是一種更為有效的方法。Wu等[13]通過(guò)設(shè)計(jì)特殊引物最終將線性片段形成了類似于質(zhì)粒的環(huán)形DNA分子，提高了目的基因片段對(duì)核酸外切酶的抵御能力。

通過(guò)提高局部有效模板濃度是提高無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量的另一種方法。Park等[14]將線性模板DNA分子與X形DNA銜接以產(chǎn)生用于組合的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)的DNA水凝膠。與可溶性DNA模板對(duì)照相比，在小麥胚芽無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，該方法使得蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了300倍。這是因?yàn)閷?duì)內(nèi)源性DNA酶消化的基因進(jìn)行保護(hù)，可通過(guò)降低DNA溶解度以產(chǎn)生更高的總基因濃度，同時(shí)由于基因的局限定位產(chǎn)生更快的酶周轉(zhuǎn)率，從而提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

2.2 代謝調(diào)控

1999年開(kāi)始，Kim和Swartz課題組進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)揭示了代謝網(wǎng)絡(luò)[15-17]。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：可以將蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)化為可分析和控制的生化反應(yīng)，推動(dòng)了無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的發(fā)展。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)模擬對(duì)高活性無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)是至關(guān)重要的，因?yàn)樗軌驕p輕無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)受到的基質(zhì)限制，從而提高產(chǎn)量。近年來(lái)，通過(guò)改變提取物制備方法得到更好的提取物，這些技術(shù)激活了無(wú)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的中樞代謝，擴(kuò)大了反應(yīng)規(guī)模。最近對(duì)大腸桿菌提取物制備方法中的每個(gè)步驟都進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。例如，開(kāi)發(fā)了新的培養(yǎng)基用于源細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)[18]，通過(guò)高密度發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)提取物[19]，同時(shí)制備方法的簡(jiǎn)化可減少時(shí)間和成本。優(yōu)化提取物制備方法有利于無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的放大。

激活細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)合成能力是非常重要的。通過(guò)刺激中樞代謝來(lái)給高水平無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成供應(yīng)能量，而不是由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)等昂貴的化合物來(lái)供應(yīng)能量。Jewett等[20]研究在反應(yīng)中激活中樞代謝，氧化磷酸化和蛋白質(zhì)合成，為蛋白質(zhì)合成提供能量(在2 h內(nèi)達(dá)到1.2 mg/mL)。除了激活有益的途徑，還可以除去有害的途徑。例如，通過(guò)刪除編碼有害酶的基因使氨基酸底物穩(wěn)定化，實(shí)現(xiàn)高水平的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成[3,21-22]。

2.3 蛋白質(zhì)折疊

在過(guò)去十幾年中，研究者試圖高效合成復(fù)雜蛋白質(zhì)，但蛋白質(zhì)的功能與它能否正確折疊有關(guān)。為了折疊復(fù)雜的蛋白質(zhì)，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)必須將靶蛋白的疏水區(qū)域彼此屏蔽，提供適宜的天然化學(xué)環(huán)境，并加入輔助因子如鐵-硫簇，促進(jìn)二硫鍵的形成和異構(gòu)化。無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的一個(gè)主要困難是復(fù)制體內(nèi)氧化折疊途徑，促進(jìn)二硫鍵的形成和異構(gòu)化[23]。生物系統(tǒng)使用不同的區(qū)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)合成與氧化折疊分開(kāi)，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)希望在一個(gè)空間中完成這兩項(xiàng)任務(wù)。盡管困難重重，但在含有多個(gè)二硫鍵的真核蛋白的折疊方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。Swartz及其同事研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)平衡氧化還原電位在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中建立氧化環(huán)境，促進(jìn)二硫鍵形成。他們通過(guò)使用碘乙酰胺預(yù)處理細(xì)胞提取物，使用谷胱甘肽緩沖液提供氧化環(huán)境，并提供形成二硫鍵的蛋白質(zhì)DsbC，成功合成了活性尿激酶[24]和截短形式的組織纖溶酶原激活物[23]。

為了形成和異構(gòu)化二硫鍵，幫助新生多肽達(dá)到其活性構(gòu)象而不聚集，也可以利用多種酶。添加這些酶分子對(duì)體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)是至關(guān)重要的。除天然折疊物之外，還可使用一些合成的物質(zhì)。Welsh等[25]將真核Hsp70伴侶BiP與觸發(fā)因子系在一起，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，真核生物分泌的蛋白質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)量得到改善。Sasaki等[26]通過(guò)將兩親性多糖納米凝膠摻入無(wú)細(xì)胞反應(yīng)來(lái)改善蛋白質(zhì)折疊，允許肽鏈的結(jié)合然后控制釋放，防止一些蛋白質(zhì)的聚集和錯(cuò)誤折疊。這些例子展示了通過(guò)直接添加新組件來(lái)調(diào)整無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)組件的設(shè)計(jì)自由度。

2.4 工程化研究

專注于底物可用性引起技術(shù)開(kāi)發(fā)的重大轉(zhuǎn)變。例如，使用連續(xù)交換或雙層系統(tǒng)，被動(dòng)擴(kuò)散能夠補(bǔ)充基質(zhì)并除去副產(chǎn)物。封閉的批次系統(tǒng)使所提供能量基質(zhì)得到有效利用，且易于放大以及許多蛋白質(zhì)的平行表達(dá)。另外，連續(xù)進(jìn)料可以大大延長(zhǎng)系統(tǒng)的反應(yīng)壽命和蛋白質(zhì)產(chǎn)量[27]。

冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展也推動(dòng)了無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展，運(yùn)用冷凍干燥技術(shù)，將配好的無(wú)細(xì)胞體系與基因模板分別冷凍干燥，當(dāng)需要它們反應(yīng)時(shí)，只需將它們混合在一起，加水活化即可，它們之間就能發(fā)生反應(yīng)合成蛋白質(zhì)。通常，冷凍干燥能使它們的活性在室溫下保持一年[28]。結(jié)合活化有效能量代謝的進(jìn)展，支持長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)生產(chǎn)與新的提取物制備方法，Zawada等[29]開(kāi)發(fā)了一種大型大腸桿菌無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，他們開(kāi)發(fā)的無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)能夠在100 L的規(guī)模下10 h內(nèi)產(chǎn)生700 mg/L的人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)。這種技術(shù)使蛋白質(zhì)藥物的商業(yè)化生產(chǎn)成為可能。

3 前沿應(yīng)用

3.1 基因電路開(kāi)發(fā)

模塊化基因電路的開(kāi)發(fā)是合成生物學(xué)家工具箱中的重要工具，因?yàn)樗试S快速組裝和控制新穎的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。在體內(nèi)基因電路方面已經(jīng)取得了進(jìn)展。然而，體外方法提供了更加獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，包括：反應(yīng)環(huán)境的控制和可預(yù)測(cè)性；允許加速原型設(shè)計(jì)；更易對(duì)反應(yīng)電路進(jìn)行真正模塊化。一個(gè)應(yīng)用例子是加速原型循環(huán)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，允許在8 h內(nèi)對(duì)4組分遺傳開(kāi)關(guān)進(jìn)行原型設(shè)計(jì)[30]。

利用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)設(shè)計(jì)原型周期的快速性，已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多無(wú)細(xì)胞電路，如邏輯門[31]、存儲(chǔ)元件[32]和振蕩器[33]。這些無(wú)細(xì)胞遺傳電路的應(yīng)用是簡(jiǎn)化人工細(xì)胞和細(xì)胞樣微器件的工程設(shè)計(jì)。一個(gè)應(yīng)用例子是在33 fL～16 pL的微乳液滴中振蕩器的演示[34]。在每個(gè)微乳液中，通過(guò)初始試劑濃度的變化產(chǎn)生豐富多樣的反應(yīng)群體。這種誘導(dǎo)的變異性可以用于以超高通量方式產(chǎn)生大數(shù)據(jù)集，用于表征非線性生化網(wǎng)絡(luò)和電路行為的參數(shù)估計(jì)。

3.2 膜蛋白

膜蛋白合成是另一個(gè)非常受到重視的應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，膜蛋白占所有潛在藥物靶標(biāo)的3/4[35]。然而，由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、疏水跨膜區(qū)域、對(duì)宿主的毒性、所需的耗時(shí)長(zhǎng)且低效率的折疊步驟，使得它們?cè)隗w內(nèi)大量表達(dá)難以實(shí)現(xiàn)。現(xiàn)在證據(jù)表明使用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以生產(chǎn)用于生物化學(xué)或結(jié)構(gòu)研究的高水平表達(dá)膜蛋白，現(xiàn)將成功的例子總結(jié)于表2中。使用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)系統(tǒng)合成膜蛋白的關(guān)鍵思路是在有助于溶解膜蛋白質(zhì)的脂質(zhì)或去污劑的存在下合成膜蛋白。例如，直接添加表面活性劑或純化的脂質(zhì)可以防止膜蛋白多肽的聚集[41]；也可以用純化的大腸桿菌磷脂雙層囊泡來(lái)代替表面活性劑，使用這種方法，成功表達(dá)了兩種膜蛋白——四環(huán)素泵(TetA)和甘露醇通透酶(MtlA)，分別獲得了高達(dá)570 μg/mL和130 μg/mL的產(chǎn)量，產(chǎn)量是細(xì)胞表達(dá)方法的400倍[42]。

Noireaux等[43]利用磷脂囊泡封閉無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)，通過(guò)表達(dá)孔形成蛋白α-溶血素，蛋白質(zhì)能夠成功整合到磷脂雙層中并形成小分子選擇性滲透通道。該技術(shù)也可應(yīng)用于進(jìn)一步探究膜蛋白和磷脂雙層的相互作用。

表2 無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)系統(tǒng)用于膜蛋白的合成

3.3 生物醫(yī)藥蛋白

由于成本、工業(yè)放大和蛋白質(zhì)折疊不再是無(wú)細(xì)胞技術(shù)不可逾越的障礙，因此可以利用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成進(jìn)行商業(yè)化生物醫(yī)藥蛋白的生產(chǎn)。首先，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以用于抗體的生產(chǎn)。例如，在生產(chǎn)HER2抗體和抗體片段時(shí)，加入分子伴侶(酵母和大腸桿菌蛋白二硫鍵異構(gòu)酶)以促進(jìn)原核無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生大量的活性蛋白質(zhì)，產(chǎn)量高達(dá)300 mg/L[44]。

其次，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)還可以用來(lái)合成疫苗。無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是易于調(diào)整DNA模板濃度來(lái)優(yōu)化反應(yīng)，調(diào)整產(chǎn)物穩(wěn)定性和控制氧化還原電位來(lái)優(yōu)化二硫鍵的形成。這一控制使得研究人員能夠快速產(chǎn)生淋巴瘤個(gè)性化疫苗[7]。無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠大量表達(dá)毒性蛋白質(zhì)。這可以改善疫苗的開(kāi)發(fā)能力，特別是在瘧疾研究方面。因?yàn)樵谘芯刊懠矔r(shí)，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的蛋白質(zhì)基因中A/T含量高，所以無(wú)法在生物體內(nèi)產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)用于相關(guān)研究。例如，在大腸桿菌細(xì)胞中重組表達(dá)108個(gè)瘧疾蛋白，但是僅有60%能夠成功生產(chǎn)[45]。疫苗在體內(nèi)生產(chǎn)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是易產(chǎn)生錯(cuò)誤的糖基化免疫原性蛋白，這可能促進(jìn)不正確的免疫應(yīng)答。Tsuboi等[45]使用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)了478種瘧疾蛋白質(zhì)，避免了蛋白質(zhì)的糖基化，因?yàn)榇藷o(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中沒(méi)有糖基化酶。Doolan等[46]使用了一種補(bǔ)充含有稀有tRNA的大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，以促進(jìn)A/T豐富區(qū)的翻譯，成功表達(dá)了250種瘧疾相關(guān)蛋白，效率高于90%。因此，利用這些無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)能夠產(chǎn)生快速疫苗篩選所必需的蛋白質(zhì)。

最后，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可用于類病毒顆粒的合成[45]。類病毒顆粒的合成也是疫苗領(lǐng)域非常受人關(guān)注的，它是一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的自組裝復(fù)合物，尺寸為25～100 nm，在結(jié)構(gòu)上與病毒相似，它能引起免疫原性反應(yīng)，但不含有遺傳物質(zhì)，也沒(méi)有感染性，同時(shí)，病毒樣顆粒的多價(jià)特性增加了免疫原性，因此有多種功能。雖然在生物體內(nèi)生產(chǎn)病毒樣顆粒已經(jīng)進(jìn)行了許多年，但仍然存在不能有效生產(chǎn)的問(wèn)題，例如在生物體內(nèi)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞毒性和對(duì)單體蛋白過(guò)度表達(dá)的控制[47]。然而使用無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)，可以快速優(yōu)化且穩(wěn)定生產(chǎn)的病毒樣顆粒。例如，用于疫苗開(kāi)發(fā)的無(wú)細(xì)胞合成應(yīng)用是將非天然氨基酸摻入細(xì)菌鞭毛蛋白中，隨后將其固定在病毒樣顆粒上。當(dāng)輔因子和相關(guān)試劑被快速優(yōu)化后，鞭毛蛋白的產(chǎn)量從263 μg/mL增加到336.3 μg/mL。與游離鞭毛蛋白相比，病毒樣顆粒固定的鞭毛蛋白的生物活性提高了10倍，為新一代超級(jí)疫苗奠定了基礎(chǔ)[48]。

3.4 非天然氨基酸

非天然氨基酸嵌入是一個(gè)強(qiáng)大的合成生物學(xué)工具，它會(huì)導(dǎo)致獨(dú)特的化學(xué)基團(tuán)嵌入蛋白質(zhì)。該技術(shù)具有許多應(yīng)用前景，如配體-蛋白質(zhì)相互作用、生物治療和生物催化等[49]。

非天然氨基酸嵌入有兩種主要的方法。一種是全局抑制，利用天然翻譯機(jī)器將非天然氨基酸嵌入蛋白質(zhì)；另一種是最常用的琥珀抑制，利用琥珀終止密碼子，依賴于正交的突變氨酰tRNA合成酶/tRNA配對(duì)，將非天然氨基酸嵌入蛋白質(zhì)。無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)已成功應(yīng)用于這兩種方法，并且非常容易地通過(guò)優(yōu)化非天然氨基酸的濃度以避免非天然氨基酸嵌入的低效率瓶頸[49]。在無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)中，還可通過(guò)優(yōu)化氨酰tRNA合成酶/tRNA配對(duì)、反應(yīng)條件的實(shí)時(shí)測(cè)定等來(lái)提高嵌入效率。另一種無(wú)細(xì)胞合成改善非天然氨基酸嵌入的方法是控制正交tRNA(otRNA)含量[50]，這種共表達(dá)是通過(guò)提供更高濃度的otRNA來(lái)提高產(chǎn)量，同時(shí)避免otRNA表達(dá)和純化之前成本昂貴的步驟。

3.5 高通量分析

在后基因組時(shí)代，高通量蛋白質(zhì)表達(dá)平臺(tái)變得越來(lái)越重要。無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的很多優(yōu)點(diǎn)可以滿足這一需求。第一，直接使用PCR模板，可避免時(shí)間長(zhǎng)及操作繁瑣的分子克隆步驟；第二，經(jīng)濟(jì)高效的高產(chǎn)量分批反應(yīng)，使多孔(96或384孔)蛋白質(zhì)生產(chǎn)成為可行；第三，使用小型化和自動(dòng)化的微芯片，使其具有巨大的應(yīng)用潛力；第四，沒(méi)有細(xì)胞壁屏障，使得反應(yīng)條件易被操縱，包括向系統(tǒng)摻入同位素標(biāo)記的氨基酸來(lái)跟蹤反應(yīng)。

在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，可利用核磁共振(NMR)技術(shù)分析同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或用X線晶體學(xué)來(lái)研究相關(guān)蛋白，這些工作在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中起著至關(guān)重要的作用。無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是高的氨基酸嵌入效率及高蛋白表達(dá)產(chǎn)率。另外，在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中表達(dá)的產(chǎn)物無(wú)需純化，可以直接進(jìn)行核磁共振分析，目前已經(jīng)使用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)確定了數(shù)千種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成平臺(tái)也可作為大規(guī)模合成功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)文庫(kù)的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái)。例如，使用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以快速有效地產(chǎn)生蛋白原位陣列(PISA)，以全面研究微芯片上的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[51-52]。小麥胚芽無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)被稱為“人類蛋白質(zhì)工廠”，試圖用來(lái)合成13 364個(gè)人類蛋白質(zhì)。在合成的蛋白質(zhì)(12 996個(gè)或總數(shù)的97.2%)中，許多蛋白質(zhì)經(jīng)測(cè)試后顯示了其特有的功能(例如75個(gè)測(cè)試的磷酸酶中的58個(gè)都有活性)，并且成功地將99.86%的蛋白質(zhì)印刷到載玻片上構(gòu)建成蛋白質(zhì)微陣列[53]。因?yàn)闊o(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)在合成時(shí)，無(wú)需將蛋白質(zhì)合成、純化和固定的步驟分開(kāi)進(jìn)行，所以這樣可更快地來(lái)探測(cè)蛋白質(zhì)的不同方面的功能。另外，結(jié)合功能化碳納米管材料，則降低蛋白質(zhì)的檢測(cè)限[54]。除了蛋白質(zhì)陣列之外，其他功能基因組學(xué)方法，如序列蛋白表達(dá)等，有望幫助揭示每一種基因所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，可以解決細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)難以解決的問(wèn)題。無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)獨(dú)特的開(kāi)放性，使得它能夠?qū)虮磉_(dá)、底物優(yōu)化和原位監(jiān)測(cè)等達(dá)到精確控制，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成的精確且個(gè)性化的工程設(shè)計(jì)。此外，隨著無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)成本的降低、效率的提高及工業(yè)放大化的逐步實(shí)現(xiàn)，使得無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)不僅僅可以作為基礎(chǔ)研究工具，也可以作為良好的工業(yè)化生產(chǎn)平臺(tái)。將來(lái)，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展，需要進(jìn)一步降低成本、提高效率，需要實(shí)現(xiàn)更好的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，同時(shí)提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性。此外，為了進(jìn)一步拓展無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，需要和材料學(xué)、自動(dòng)化和生物醫(yī)學(xué)等學(xué)科進(jìn)行更進(jìn)一步的融合。

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