辣椒熱激轉(zhuǎn)錄因子家族在馴化過程中的演變

李 菲，龔記熠，孫媛媛，乙 引

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550001)

不能移動的植物生存在變動的環(huán)境中,需要應(yīng)對各種不利的環(huán)境條件。目前針對植物抗性的研究,往往聚焦于某一單一逆境。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),61%的雙重脅迫誘導(dǎo)的基因在任何一個(gè)單一脅迫環(huán)境下都不會誘導(dǎo)表達(dá)[1]。因此,有必要研究植物響應(yīng)多重脅迫的機(jī)制[2-3]。

植物應(yīng)對多種逆境的方法之一是利用多效熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat Shock Transcription Factors,HSFs)——熱激蛋白/分子伴侶(heatshock protein/chaperone)信號傳導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。逆境影響植物正常生長的分子機(jī)制,是阻礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)正常進(jìn)行生理功能。蛋白質(zhì)變性是任何逆境都會引發(fā)的后果。所以,任何會引起蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的逆境,都需要植物基因組中熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)信號傳導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來應(yīng)對[4]。熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)信號傳導(dǎo)途徑的作用不僅限于熱應(yīng)激響應(yīng),而且還涉及多種脅迫,如冷、滲透、干旱、鹽、紫外線、高光、氧化和病原體侵染脅迫[5]。

HSF存在于所有真核生物中,但與釀酒酵母中的1個(gè)HSF或人類中7個(gè)HSFs基因相比,植物基因組中普遍存在大量HSFs基因(大豆中38個(gè),水稻中25個(gè),擬南芥21個(gè))[6]。植物中HSF家族的多樣性造成了研究的困難。然而,表達(dá)模式、基因突變和過表達(dá)研究顯示了擬南芥HSFs家族基因在抗多種逆境脅迫和發(fā)育中的獨(dú)特和重疊的功能[7]。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)分為A,B和C3類[8-10]。大量的HSFs成員基因及其以異源多聚體的形式發(fā)揮功能的特征,使得特定基因的功能研究非常困難。多個(gè)HSFs基因在植物干旱、鹽、強(qiáng)光、冷脅迫等的信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控中起作用。它們可以被ABA依賴性或非依賴的信號通路誘導(dǎo)。HSFA3是DREB2A轉(zhuǎn)錄因子)的靶點(diǎn),由多種脅迫如干旱、鹽、熱和冷以及氧化脅迫、紫外光UVB和傷害誘導(dǎo)[11-12]。AtHSFA6a的啟動子包含兩個(gè)ARE(ABA反應(yīng)元件),并在體外結(jié)合3種ABA響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子:AREB1,ABF3和AREB3[13]。過表達(dá)AtHSFA6a的植物表現(xiàn)出抗鹽脅迫和抗旱能力。B類和C類HSFs基因缺少A類HSFs基因調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性所必需的結(jié)構(gòu)域AHA (aromatic hydrophobic acidic),因此被認(rèn)為是抑制性轉(zhuǎn)錄因子。

在非模式植物中,HSFs轉(zhuǎn)錄因子的功能也有研究[14]。辣椒營養(yǎng)豐富,是我國西南省份重要的經(jīng)濟(jì)作物。利用重要的栽培辣椒品種遵辣一號(C.apsicumannuumLZunla1),及其野生祖先品系Chiltepin(C.annuumvar.glabriusculum)的基因組測序和注釋結(jié)果。本研究分析了野生辣椒和栽培辣椒基因組中HSFs基因家族的成員組成、系統(tǒng)分類和可能功能,以及馴化過程中辣椒基因組中HSFs基因家族發(fā)生的演變。本研究為辣椒品系應(yīng)對多種逆境的機(jī)制研究和品種改良提供了基因資源。

1 材料與方法

1.1 擬南芥HSFs基因家族序列和辣椒基因組序列來源

擬南芥HSFs基因家族序列來源于擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR。栽培辣椒遵辣一號和其野生祖先品系Chiltepin的基因組序列及其注釋信息可以從NCBI Genome數(shù)據(jù)庫下載。

1.2 辣椒基因組中HSFs基因的檢索和篩選

辣椒基因組中HSFs基因的檢索工具是本地BLAST軟件。將下載到的栽培辣椒遵辣一號和其野生祖先品系Chiltepin的基因組序列及其注釋信息,構(gòu)建本地核苷酸和氨基酸數(shù)據(jù)庫。以擬南芥HSFs家族全部序列信息為檢索序列,進(jìn)行本地BLAST。保留檢索到的E值小于0001的序列。

下一步對這些序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)構(gòu)域分析是在Pfam在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫中,進(jìn)行這些序列的結(jié)構(gòu)域檢索。保留含有HSFs特征性結(jié)構(gòu)域:HSF-DNAbind結(jié)構(gòu)域的序列,用于后續(xù)分析。

1.3 栽培辣椒和野生辣椒HSFs基因家族的染色體定位比較

栽培辣椒和野生辣椒HSFs基因家族成員的染色體定位信息可以根據(jù)基因序列號從基因組序列信息中查詢到。根據(jù)基因的染色體定位信息,使用MapInspect軟件分別構(gòu)建出栽培辣椒和野生辣椒HSFs基因家族成員的染色體定位圖譜,并進(jìn)行比對和解讀。

1.4 辣椒基因組中HSFs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對擬南芥、栽培辣椒遵辣一號和野生辣椒品系Chiltepin 全部HSFs基因序列進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,使用的軟件是MEGA70。序列比對使用的算法是Clustal W。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建使用的算法是Neighbor Joining。

2 結(jié)果與討論

2.1 辣椒基因組中HSFs基因的鑒定和特征初步分析

在西南各省廣泛種植的栽培辣椒品種遵辣一號(C.apsicumannuumLZunla1),和其野生祖先品系Chiltepin(C.annuumvar.glabriusculum)的基因組測序已經(jīng)完成,序列及注釋信息均公開(http://peppersequencegenomicscn/page/species/indexjsp)。使用擬南芥HSFs基因家族的基因序列,可以從辣椒基因組中挖掘出其中的HSFs基因。

表1 遵辣一號(C. apsicum annuum LZunla1)基因組中HSFs基因信息列表Tab.1 The HSFs genes in the C. apsicum annuum L Zunla1 genome

在栽培辣椒遵辣一號基因組中共鑒定出25個(gè)HSFs基因,其野生祖先品系Chiltepin中鑒定出26個(gè)HSFs基因。這一HSFs基因家族成員數(shù)目與其他植物(擬南芥21,水稻25個(gè),大豆38個(gè))相差不多(Fujimoto and Nakai 2010)，但比其他生物,如動物和酵母多。這應(yīng)該與植物必須靜止應(yīng)對多種逆境脅迫有關(guān)。辣椒基因組經(jīng)過重復(fù)序列的擴(kuò)增,比其他植物大很多(辣椒3364Mbp;擬南芥125Mbp;水稻466Mbp; 大豆1100Mbp)。但是，基因組中HSFs功能基因的數(shù)量,辣椒并沒有比其他植物更多。

2.2 栽培辣椒和野生辣椒品系基因組中HSFs基因的染色體定位

栽培辣椒品種遵辣一號(C.apsicumannuumLZunla1),和其野生祖先品系Chiltepin(C.annuumvar.glabriusculum)的農(nóng)藝性狀,包括株高、株型、果實(shí)大小等有巨大的差異,在抗性方面也有不同的表現(xiàn)。從HSFs基因染色體位置看,與其野生祖先品系Chiltepin比較,遵辣一號HSFs基因家族基本一致。大部分HSFs基因在馴化過程中沒有發(fā)生染色體位置變化。在遵辣一號品種一號和七號染色體上,分別丟失了1個(gè)HSFs基因(Capang01g003145和Capang07g001960)。遵辣一號基因組中有1個(gè)HSF基因,在注釋過程中未能定位到任何一個(gè)染色體上(Capana00g000109)。這個(gè)基因和Chiltepin野生辣椒品系的Capang04g002355基因在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚集在一個(gè)分支,與Chiltepin基因組中Capang01g003145和Capang07g001960并沒有相近的親緣關(guān)系。

2.3 栽培辣椒和野生辣椒品系基因組中HSFs基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

對于HSFs基因家族的功能,研究的最透徹的還是擬南芥。將擬南芥、栽培辣椒遵辣一號和野生辣椒Chiltepin的全部HSFs基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,如圖2。

與擬南芥一樣,辣椒HSFs基因家族分成了A/B/C3個(gè)亞家族。從系統(tǒng)發(fā)育樹中,可以清晰地看到辣椒HSFs基因在擬南芥中的同源基因。遵辣一號的HSFs基因,一般與Chiltepin的HSFs基因一一對應(yīng),位于同一分支。少數(shù)幾個(gè)例外包括:Capana00g000109和Chiltepin野生辣椒品系的Capang04g002355在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚集在一個(gè)分支;Chiltepin野生辣椒品系的Capang07g001960基因在遵辣一號中沒有對應(yīng)基因;遵辣一號的Capana08g000497 與Chiltepin野生辣椒品系的Capang01g003145基因聚集在一個(gè)分支。

圖1 栽培辣椒遵辣一號” Zunla1”和野生辣椒品系” Chiltepin”基因組中HSFs基因的染色體定位圖譜Fig.1 Chromosomal location map of HSFs gene in the genome of the cultivated pepper "Zunla1" and its wild ancestor "Chiltepin"

2.4 栽培辣椒和野生辣椒品系基因組中HSFs基因的可能功能

HSFs基因家族成員,尤其是HSFAs亞家族的成員,功能研究的報(bào)道已經(jīng)有很多。系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了與擬南芥HSFAs基因同源的辣椒基因。這為對辣椒HSFs基因進(jìn)行功能研究提供了很好的線索。

在擬南芥中,熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFA1abd和e組成型表達(dá),負(fù)責(zé)觸發(fā)熱應(yīng)激反應(yīng)(HSR,heat stress response)[11]。這些轉(zhuǎn)錄因子與熱激蛋白啟動子區(qū)域的熱應(yīng)激因子(HSE heat stress elements)元件結(jié)合以激活熱激蛋白HSP的轉(zhuǎn)錄。此外,這些基因也可激活其他熱激轉(zhuǎn)錄因子,包括HSFA2、HSFA3和HSFA7a的表達(dá),賦予植株長時(shí)間的脅迫抗性[15]。這些信號通路中,HSFA2處于重要的中心位置。已經(jīng)充分證明,HSFA2的過表達(dá)可增強(qiáng)植株對熱、缺氧、鹽、滲透脅迫、強(qiáng)光和氧化脅迫的抵抗力[16]。

與擬南芥HSFA2基因同源的是遵辣一號的Capana08g000497 與Chiltepin野生辣椒品系的Capang01g003145基因。遵辣一號的Capana08g000497 與Chiltepin的Capang01g003145兩個(gè)基因相似度為100%。與擬南芥HSFA2基因相似度為89%。鑒于HSFA2基因?qū)τ跀M南芥多種抗性的重要作用,研究遵辣一號的Capana08g000497 與Chiltepin的Capang01g003145基因在辣椒中的功能,具有重要的意義。

這一重要的抗逆基因,在馴化過程中,由Chiltepin一號染色體移動到遵辣一號的八號染色體。這一基因移位發(fā)生的時(shí)間和機(jī)制、基因移位對該基因表達(dá)的影響,以及對栽培辣椒抗逆性的影響,是研究栽培辣椒抗逆性的關(guān)鍵問題。

圖2 栽培辣椒遵辣一號” Zunla1”和野生辣椒品系” Chiltepin”基因組中HSFs基因與擬南芥HSFs基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of HSFs gene in the genome of Arabidopsis, the cultivated pepper "Zunla1" and its wild ancestor "Chiltepin"

3 結(jié) 論

氣候?yàn)?zāi)害環(huán)境給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn),極大的危害農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的穩(wěn)定性。目前對植物抗逆的研究,主要集中在對單個(gè)逆境的研究。這很難解決實(shí)際生產(chǎn)中遇到的多種逆境同時(shí)發(fā)生的情況。植物基因組中的熱激轉(zhuǎn)錄因子——熱激蛋白信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控途徑,是植物在各種脅迫環(huán)境下,均會激活以便維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)正常生理功能的重要抗逆機(jī)制。本文以研究相對透徹的擬南芥HSFs基因家族已知信息為基礎(chǔ),挖掘辣椒栽培品種遵辣一號(CapsicumannuumLZunla1),及其野生祖先品系Chiltepin(C.annuumvar.glabriusculum)基因組中HSFs基因,并對這些基因進(jìn)行系統(tǒng)的比對和功能分析。

盡管辣椒基因組遠(yuǎn)大于擬南芥,其基因組中HSFs基因的數(shù)目并沒有更多。對辣椒和其他茄科植物,如番茄、茄子等的基因組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)辣椒基因組中重復(fù)序列發(fā)生了大規(guī)模的擴(kuò)增,但是基因數(shù)目并沒有增加[17]。對辣椒基因組中HSFs基因家族的分析,為此論斷提供一個(gè)新的例證。

在栽培辣椒和其野生祖先辣椒品系基因組中,HSFs基因家族比較保守。栽培辣椒遵辣一號(C.apsicumannuumLZunla1)基因組中,HSFs基因家族成員的數(shù)目、染色體位置和序列,與其野生祖先大體上保持了一致。但是，可提高擬南芥對多種逆境抗性的重要基因,HSFA2,在遵辣一號及其野生祖先Chiltepin中的同源基因發(fā)生了移位。這一基因移位對于栽培辣椒與其野生祖先抗逆性的差異之間的關(guān)聯(lián),是值得研究的問題。本研究為分析辣椒HSFs基因家族成員的功能提供了有價(jià)值的信息,為辣椒品種多種抗逆能力的改善,積累了基因資源。

[1] RASMUSSEN S, BARAHarah P, SUAREZRODRIGUEZ M C, et al. Transcriptome responses to combinations of stresses in arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2013, 161(4):1783-1794.

[2] MITTLER R, BLUMWALD E. Genetic engineering for modern agriculture: Challenges and perspectives[J]. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61(1):443-462.

[3] NOBUHIRO SUZUKI, RIVERO R M, VLADIMIR S, et al. Abiotic and biotic stress combinations[J]. New Phytologist, 2014, 203(1):32-43.

[4] CAREY C C, GORMAN K F, RUTHERFORD S. Modularity and intrinsic evolvability of Hsp90-buffered change[J]. Plos One, 2006, 1(1):76.

[5] SWINDELL W R, HUEBNER M, WEBER A P. Transcriptional profiling of Arabidopsis heat shock proteins and transcription factors reveals extensive overlap between heat and non-heat stress response pathways[J]. Bmc Genomics, 2007, 8(1):125.

[6] FUJIMOTO M, NAKAI A. The heat shock factor family and adaptation to proteotoxic stress[J].Febs Journal, 2010, 277(20):4112-4125.

[7] VON K P, SCHARF K D, NOVER L. The diversity of plant heat stress transcription factors[J].Trends in Plant Science, 2007, 12(10):452-457.

[8] DORING P. Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: How many heat stress transcription factors do we need?[J]. Cell Stress & Chaperones, 2001, 6(3):177-189.

[9] SCHARF K D, BERBERICH T, EBERSBERGER I, et al. The plant heat stress transcription factor (Hsf) family:Structure, function and evolution.[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2012, 1819(2):104-119.

[10] GUO M, LIU J H, MA X, et al. The plant Heat Stress Transcription factors (HSFs): Structure, regulation, and function in response to abiotic stresses[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7(273):114.

[11] YOSHIDA T, SAKUMA Y, TODAKA D, et al. Functional analysis of an Arabidopsis, heat-shock transcription factor HsfA3, in the transcriptional cascade downstream of the DREB2A stress-regulatory system[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2008, 368(3):515-521.

[12] DEBBIE WINTER, BEN VINEGAR, HARDEEP NAHAL, et al. An "Electronic Fluorescent Pictograph" browser for exploring and analyzing Large-Scale biological data sets[J]. PloS one, 2007, 2(8):e718.

[13] HWANG S M, KIM D W, WOO M S, et al. Functional characterization of Arabidopsis HsfA6a as a heat-shock transcription factor under high salinity and dehydration conditions[J]. Plant Cell & Environment, 2014, 37(5):1202-1222.

[14] MISHRA S K, TRIPP J, WINKELHAUS S, et al. In the complex family of heat stress transcription factors, HsfA1 has a unique role as master regulator of thermotolerance in tomato[J]. Genes & Development, 2002, 16(12):1555-1567.

[15] NISHIZAWAYOKOI A, NOSAKA R, HAYASHI H, et al. HsfA1d and HsfA1e involved in the transcriptional regulation of HsfA2 function as key regulators for the Hsf signaling network in response to environmental stress[J]. Plant & Cell Physiology, 2011, 52(5):933-945.

[16] DAISUKE OGAWA, KAZUO YAMAGUCHI, TAKUMI NISHIUCHI. High-level overexpression of the Arabidopsis HsfA2 gene confers not only increased themotolerance but also salt/osmotic stress tolerance and enhanced callus growth[J]. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(12):33-73.

[17] QIN C, YU C, SHEN Y, et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(14):5135-5140.