響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助北蒼術(shù)多酚提取工藝及其DPPH自由基清除能力研究

陳克克,強(qiáng) 毅

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院/基因工程實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710065;2.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710119)

北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)為菊科蒼術(shù)屬植物,主產(chǎn)于陜西、內(nèi)蒙古、河北、山西、河南、甘肅、吉林、遼寧、黑龍江等地[1-2],其干燥根莖入藥為蒼術(shù)(ATRACTYLODIS RHIZOMA)。蒼術(shù)為我國(guó)常用中藥材,具有降血壓、抗心律失常、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖咕?、抗炎、利尿、保肝等作用[3-7],主要用于濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、腳氣痿蹙、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、眼目昏澀等癥。國(guó)內(nèi)、外關(guān)于蒼術(shù)化學(xué)成分的研究表明,蒼術(shù)含有揮發(fā)油、多糖、倍半萜類化合物、三萜類化合物、聚乙炔類化合物、類固醇、香豆素等活性成分[8-14],其中科研工作人員對(duì)蒼術(shù)揮發(fā)油開(kāi)展了深入透徹的研究,分別從蒼術(shù)揮發(fā)油的分類鑒定、化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用等方面進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。目前，尚未見(jiàn)對(duì)蒼術(shù)多酚的研究報(bào)道。多酚是廣泛分布于植物體內(nèi)的一類重要的次生代謝物質(zhì),化學(xué)性質(zhì)獨(dú)特,藥理活性多樣,已經(jīng)成為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分之一,在食品、醫(yī)藥保健、化學(xué)及化妝品等領(lǐng)域均有應(yīng)用,因此對(duì)蒼術(shù)多酚展開(kāi)研究十分必要。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法研究了北蒼術(shù)多酚的提取工藝，并探討了北蒼術(shù)多酚的體外DPPH自由基清除能力,以期為蒼術(shù)資源的綜合開(kāi)發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北蒼術(shù)采自陜西省太白縣,經(jīng)西安文理學(xué)院杜喜春副教授鑒定為菊科蒼術(shù)屬植物北蒼術(shù),取其根部干燥后粉碎過(guò)孔徑為0.425mm篩,保存?zhèn)溆谩?/p>

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,純度>98.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));沒(méi)食子酸購(gòu)于陜西標(biāo)普醫(yī)藥科技有限公司,純度>98.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));抗壞血酸(純度>98.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)))和甲醇、無(wú)水碳酸鈉(分析純)均購(gòu)于天津市天力化學(xué)試劑有限公司;Folin-Ciocalteu試劑購(gòu)于上海荔達(dá)生物科技公司。

WN-200多功能粉碎機(jī)，廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;TE412-L型電子天平，德國(guó)Sartorius儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司;KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;三用恒溫水箱，天津泰斯特儀器有限公司;TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北蒼術(shù)多酚的提取工藝 準(zhǔn)確稱量5.0 g北蒼術(shù)粉末于玻璃瓶中,按液料比加入不同濃度的乙醇提取溶劑,混合均勻后放入功率為240 W的超聲波中超聲一定時(shí)間,超聲結(jié)束后真空抽濾得淺棕色濾液。

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱量標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸13 mg,用甲醇溶解并稀釋至50 mL棕色容量瓶中,搖勻,即得濃度為0.26 mg/mL沒(méi)食子酸溶液。

精密移取該溶液0，0.1，0.4，0.5，0.6，0.8 mL于25 mL棕色容量瓶中,分別加入蒸餾水10.0 mL,Folin-Ciocalteu試劑2.0 mL,充分振蕩搖勻后靜置8 min,再依次加入15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液2.0 mL,搖勻后定容,室溫下避光靜置反應(yīng)2 h。以第1瓶空白溶液作參比,測(cè)定765 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.3 北蒼術(shù)多酚的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu分光光度法測(cè)定北蒼術(shù)多酚含量[15]。取北蒼術(shù)濾液50 μL,于765 nm處測(cè)定吸光度值,將該值代入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算北蒼術(shù)多酚的濃度。按公式(1)計(jì)算北蒼術(shù)多酚的提取量,以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。

M=(X*V1*V0)/(M1*V2)

(1)

式中：M為北蒼術(shù)多酚提取量,mg/g;X為標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的北蒼術(shù)多酚濃度,mg/mL;V0為提取北蒼術(shù)多酚時(shí)定容后的體積,mL;V1為測(cè)定北蒼術(shù)多酚時(shí)定容后的體積,mL;V2為測(cè)定多酚時(shí)移取的北蒼術(shù)濾液的體積,mL;M1為提取北蒼術(shù)多酚時(shí)北蒼術(shù)粉末質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以乙醇濃度70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、液料比25mL/g、超聲時(shí)間40 min為固定水平,考察各單因素水平對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響,以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳提取工藝參數(shù)范圍。各因素分別設(shè)置6個(gè)水平,具體為乙醇濃度40%，50%，60%，70%，80%，90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),液料比5，10，15，20，25，30mL/g,超聲時(shí)間10，20，30，40，50，60min。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助提取北蒼術(shù)多酚的實(shí)驗(yàn)方法,選取乙醇濃度(A),液料比(B)和超聲時(shí)間(C)作為影響多酚提取優(yōu)化的因素,以多酚提取量為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平及編碼表Tab.1 Levels and factors of response surface design

1.2.6 DPPH自由基清除能力 將提取得到的北蒼術(shù)多酚和抗壞血酸配成系列濃度為40，80，160，320，640，1 280，2 560和4 000 μg/mL的樣品溶液,取各濃度樣品溶液2 mL分別放置于刻度試管中,加入0.2 mmol/L無(wú)水乙醇配制的DPPH自由基溶液2 mL,混勻后室溫暗處反應(yīng)30 min,517 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。以2 mL樣品液加入2 mL無(wú)水乙醇作為空白組,以2 mL蒸餾水加入2 mL DPPH自由基溶液作為對(duì)照組,根據(jù)公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對(duì)照]×100%

(2)

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析,應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

采用沒(méi)食子酸溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)作為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)吸光度值作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=68.287X+0.003(R2=0.995 3)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1 乙醇濃度對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.2.1 乙醇濃度對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響 不同濃度的乙醇對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。北蒼術(shù)多酚的提取量隨著乙醇濃度的增大而增大,當(dāng)乙醇濃度為70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),北蒼術(shù)多酚提取量達(dá)到最大,隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大,北蒼術(shù)多酚提取量下降?？梢?jiàn),70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的乙醇濃度可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量。乙醇溶劑提取法是提取多酚類物質(zhì)的常用方法,已被廣泛應(yīng)用于石榴[15]、獼猴桃[16]、西藏野生卷葉黃精[17]、黔產(chǎn)接骨草[18]、窄葉鮮卑花[19]、米糠[20]等植物多酚類物質(zhì)的提取中。不同植物含有的多酚類物質(zhì)成分有差異,導(dǎo)致其極性不同,而不同濃度的乙醇溶劑亦有不同的極性[21],因此,提取不同植物多酚類物質(zhì)應(yīng)根據(jù)相似相溶的原理選用不同濃度的乙醇溶液。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),70%的乙醇濃度可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量,可能是70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的乙醇溶液的極性和北蒼術(shù)多酚的極性相似,故具有較大的溶解度。

2.2.2 液料比對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響 不同液料比對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。北蒼術(shù)多酚的提取量隨著液料比的增加而增大,當(dāng)液料比為25mL/g時(shí),北蒼術(shù)多酚提取量達(dá)到最大,隨著液料比的繼續(xù)增加,北蒼術(shù)多酚提取量下降。可見(jiàn),25mL/g的液料比可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量。低濃度的液料比使北蒼術(shù)多酚提取不充分,高濃度的液料比會(huì)導(dǎo)致一些其他物質(zhì)如多糖溶出,從而抑制多酚提取量[22],因此,合適的液料比對(duì)多酚類物質(zhì)的有效提取至關(guān)重要。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),米糠[20]和石榴渣[15]多酚提取時(shí)的液料比為20mL/g,獼猴桃果皮[16]和西藏野生卷葉黃精[17]多酚提取時(shí)的液料比為25mL/g,窄葉鮮卑花[19]和黔產(chǎn)接骨草[18]多酚提取時(shí)的液料比分別為60mL/g和75mL/g,由此可知,不同植物多酚類物質(zhì)提取所用的液料比均不同,實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)材料選擇合適的液料比。

圖2 液料比對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響 不同超聲時(shí)間對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。北蒼術(shù)多酚的提取量隨著超聲時(shí)間的增加而增大,在超聲時(shí)間為40 min時(shí),北蒼術(shù)多酚的提取量達(dá)到最大,之后超聲時(shí)間增加,北蒼術(shù)多酚提取量下降?？梢?jiàn),40 min的超聲時(shí)間可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量。研究證明,合適的超聲時(shí)間可以讓多酚提取的過(guò)程反應(yīng)完全,過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)因?yàn)闄C(jī)械力和熱能破壞多酚結(jié)構(gòu),導(dǎo)致多酚提取量降低[23]。以往實(shí)驗(yàn)報(bào)道,超聲輔助提取獼猴桃果皮[16]和黔產(chǎn)接骨草[18]多酚時(shí)的超聲時(shí)間分別為25 min和50 min,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),40 min的超聲時(shí)間可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量,而采用傳統(tǒng)提取法提取米糠[20]、西藏野生卷葉黃精[17]和石榴渣[15]多酚時(shí),其提取時(shí)間分別為2 h，2.5 h和3.5 h?？梢?jiàn),超聲提取法提取時(shí)間明顯縮短。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與方差分析 利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合,得到以乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)為影響因素的北蒼術(shù)多酚提取量(mg/g)的回歸方程:北蒼術(shù)多酚提取量(mg/g)=11.79+0.33A+0.094B-0.075C+0.035AB-0.26AC+0.39BC-0.69A2-0.95B2-0.70C2。

根據(jù)p值可知,一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AC，BC和二次項(xiàng)A2，B2和C2對(duì)多酚提取量的影響極顯著,一次項(xiàng)B對(duì)多酚提取率影響顯著,影響大小順序?yàn)?乙醇濃度>液料比>超聲時(shí)間。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化 影響北蒼術(shù)多酚提取量各因素間的交互作用的響應(yīng)曲面如圖4～6所示，可以得到乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間之間交互關(guān)系的直觀表現(xiàn)。響應(yīng)曲面圖的拋物面越明顯,因素之間的交互作用越強(qiáng);響應(yīng)曲面圖的拋物面越不明顯,因素之間的交互作用越弱[24]。結(jié)合P值分析可知,因素間交互作用的影響為:液料比-超聲時(shí)間的交互影響>乙醇濃度-超聲時(shí)間的交互作用,而乙醇濃度-液料比間的交互作用影響不顯著。

表2 北蒼術(shù)多酚提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Experiment design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析表Tab.3 Analysis of variance of the regression model

注:* 表示差異顯著(P<0.05),** 表示差異極顯著(P<0.01)

2.3.3 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證 由響應(yīng)面法分析數(shù)據(jù)可得出北蒼術(shù)中多酚的最佳提取工藝為:乙醇濃度為73.98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),液料比24.86 mL/g,超聲時(shí)間36.8 min,多酚的理論最佳提取量為11.90 mg/g。

根據(jù)模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為乙醇濃度74%,液料比25mL/g,超聲時(shí)間37 min,通過(guò)3次平行試驗(yàn),求得多酚的提取量為11.67±0.15 mg/g,與理論值的誤差為1.97%,說(shuō)明該回歸方程能夠真實(shí)地反映各因素對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響,可在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

圖4 乙醇濃度和液料比對(duì)多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

圖5 乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of polyphenols

圖6超聲時(shí)間和液料比對(duì)多酚提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

北蒼術(shù)多酚提取液對(duì)DPPH自由基清除率的結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知,北蒼術(shù)多酚提取液和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用,且隨著其質(zhì)量濃度的增加,清除率也增加,清除率最高分別可達(dá)到63.98%和96.02%。北蒼術(shù)多酚提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力可以用DPPH自由基清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度(IC50)來(lái)衡量。經(jīng)分析計(jì)算得出,北蒼術(shù)多酚提取液和抗壞血酸的IC50值分別為2.10 mg/mL和0.05 mg/mL,與抗壞血酸相比,北蒼術(shù)多酚提取液對(duì)DPPH自由基清除能力較弱。根據(jù)計(jì)算出的IC50值可知,北蒼術(shù)多酚提取液具有清除DPPH自由基的能力,后續(xù)可通過(guò)分離純化實(shí)驗(yàn)獲得清除能力更強(qiáng)的多酚物質(zhì)。

圖7 北蒼術(shù)多酚提取液對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH radical scavenging activity of the extract of polyphenols

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)單因素試驗(yàn)分析不同因素對(duì)北蒼術(shù)多酚提取量的影響,確定合適的提取條件;再采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助北蒼術(shù)多酚的提取工藝,并利用Design-Expert軟件分析了影響北蒼術(shù)多酚提取量的因素。其中，乙醇濃度和液料比對(duì)多酚提取量影響顯著,液料比和超聲時(shí)間的交互作用以及乙醇濃度和超聲時(shí)間的交互作用顯著。最終，得出其最佳提取工藝為:乙醇濃度74%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),液料比25mL/g,超聲時(shí)間37 min,在此條件下北蒼術(shù)多酚提取量達(dá)到(11.67±0.15) mg/g,且得到的北蒼術(shù)多酚具有較好的清除自由基的能力,可以作為天然抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。超聲波輔助提取植物多酚是一種有效的途徑,利用超聲波輔助提取北蒼術(shù)多酚可為蒼術(shù)資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù),并有利于產(chǎn)業(yè)化推廣,具有良好的應(yīng)用前景。

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