補(bǔ)腎生血湯聯(lián)合間充質(zhì)細(xì)胞治療再生障礙性貧血臨床研究

蔣英俊

(安徽省合肥市第二人民醫(yī)院，安徽 合肥 230032)

再生障礙性貧血表現(xiàn)為外周血全血細(xì)胞減少和骨髓穿刺造血細(xì)胞三系減少，是常見(jiàn)的骨髓衰竭性血液系統(tǒng)疾病，T淋巴細(xì)胞免疫紊亂是再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞，上調(diào)輔助性T細(xì)胞和造血正調(diào)控因子表達(dá)，下調(diào)造血負(fù)調(diào)抗因子，治療再生障礙性貧血具有肯定療效[2]。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為，再生障礙性貧血與腎臟、脾臟、肝臟關(guān)系密切，采用辨證施治效果較好[3]。2012年1月—2015年12月，筆者采用補(bǔ)腎生血湯聯(lián)合間充質(zhì)細(xì)胞治療再生障礙性貧血患者43例，療效較好，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇上述時(shí)期我院血液科收治的再生障礙性貧血患者86例，均經(jīng)血常規(guī)、網(wǎng)織紅細(xì)胞、骨髓形態(tài)及活檢等檢查確診，符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中慢性再生障礙性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并符合腎虛血瘀型的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)[5]：面色萎黃，唇甲淡白，頭暈，耳鳴，心悸，氣短乏力，健忘，腰膝酸軟，日久不愈，皮膚可見(jiàn)紫褐色出血點(diǎn)或瘀斑，齒、鼻衄，血色暗，舌質(zhì)暗淡，或有瘀斑，或有瘀點(diǎn)，脈細(xì)或細(xì)澀；經(jīng)規(guī)范免疫抑制治療≥12個(gè)月無(wú)效，無(wú)條件行造血干細(xì)胞移植；年齡18～70歲，性別不限；患者對(duì)研究知情并簽署知情同意書(shū)。排除嚴(yán)重肝、腎功能障礙及伴急性傳染病者，重型再生障礙性貧血合并嚴(yán)重感染未控者，孕婦、哺乳期婦女，對(duì)中藥過(guò)敏者，惡性腫瘤者，合并陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、骨髓增生異常綜合征、急性造血功能停滯、骨髓纖維化、急性白血病、惡性組織細(xì)胞病等可引起全血細(xì)胞減少疾病者，精神疾病者。隨機(jī)分為2組：對(duì)照組43例，男24例，女19例；年齡(49.72±11.02)歲；病程(23.63±18.41)個(gè)月。研究組43例，男21例，女22例；年齡(50.24±10.84)歲；病程(25.27±17.05)個(gè)月。2組性別、年齡、病程比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2治療方法 2組親緣供者經(jīng)健康體檢合格后，嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則，采集肝素抗凝骨髓40 mL，送至細(xì)胞中心分離、培養(yǎng)。對(duì)照組給予表面抗原鑒定和微生物檢測(cè)合格的第3～5代骨髓間充質(zhì)細(xì)胞回輸，每次輸注細(xì)胞數(shù)1×106kg-1，每周輸注1次，共治療4周，治療期間停用免疫抑制劑，加強(qiáng)防治感染、出血。研究組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上給予補(bǔ)腎生血湯治療，組成：制首烏12 g、熟地9 g、女貞子15 g、當(dāng)歸10 g、菟絲子15 g、仙靈脾15 g、補(bǔ)骨脂9 g、黨參30 g、丹參15 g、茜草9 g、阿膠10 g(燉化)、鹿角膠10 g(燉化)、巴戟天15 g，出血重者加蒲黃10 g，水煎至200 mL，早晚分服，1劑/d，連續(xù)服用4周。

1.3觀察指標(biāo) ①治療前后抽取患者靜脈血，檢測(cè)血常規(guī)[血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(Plt)、中性粒細(xì)胞、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度]、T淋巴細(xì)胞亞群水平。②治療前后抽取患者骨髓，檢測(cè)骨髓象、骨髓血清堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、骨髓微血管密度(MVD)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。MVD和VEGF采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。MVD計(jì)數(shù)方法：每張切片先在低倍(100 倍) 視野鏡中選出血管最豐富的3 個(gè)區(qū)域，然后在400 倍視野下計(jì)數(shù)微血管3次，取平均值，凡被CD34 免疫組織化學(xué)染色染成棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇的，均作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)。VEGF檢測(cè)：顯色主要定位于細(xì)胞的胞漿，部分細(xì)胞膜可見(jiàn)顯色，陽(yáng)性為棕黃色或棕褐色，光學(xué)顯微鏡高倍視野下計(jì)數(shù)200 個(gè)有核細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

2 結(jié) 果

2.12組治療前后血常規(guī)比較 2組治療前Hb、WBC、Plt、中性粒細(xì)胞、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后Hb、WBC、Plt和中性粒細(xì)胞均顯著升高(P均<0.05)，轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度均顯著降低(P均<0.05)，且研究組各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.22組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群比較 2組治療前CD8+、CD4+、CD4+CD25+FoxP3+、CD3+CD4+INF-γ+、CD3+CD4+IL-4+和Th1/Th2比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后CD8+、CD3+CD4+IL-17+、CD3+CD4+INF-γ+、Th1/Th2水平均顯著降低(P均<0.05)，CD4+、CD4+CD25+Foxp3+和CD3+CD4+IL-4+均顯著升高(P均<0.05)，且研究組各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 2組治療前后血常規(guī)比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對(duì)照組比較，P<0.05。

表2 2組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.32組治療前后骨髓象比較 治療前2組骨髓增生程度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后骨髓增生活躍率均顯著升高(P均<0.05)，非造血細(xì)胞百分率均顯著降低(P均<0.05)，且研究組各指標(biāo)改善情況明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.42組治療前后骨髓bFGF、MVD和VEGF比較2組治療前bFGF、MVD、VEGF水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后bFGF、MVD、VEGF均顯著升高(P均<0.05)，且研究組明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 2組治療前后骨髓增生程度比較 例(%)

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討 論

隨著研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為再生障礙性貧血是以造血細(xì)胞為靶細(xì)胞的自身免疫性疾病，免疫抑制劑治療有效為此提供了直接證據(jù)[6]。

表4 2組治療前后骨髓bFGF、MVD和VEGF比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對(duì)照組比較，P<0.05。

正常機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)取決于CD4+和CD8+T細(xì)胞平衡，而再生障礙性貧血患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，表現(xiàn)為T細(xì)胞增多和功能活化，外周血CD4+比例減少，CD8+升高，CD4+/CD8+比值降低，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[7]。CD4+是再生障礙性貧血的重要驅(qū)動(dòng)者和參與者，CD4+包括Th1細(xì)胞(CD4+INF+T細(xì)胞)、Th2細(xì)胞(CD4+IL-4+T細(xì)胞)、Treg、Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+T細(xì)胞)，這些細(xì)胞在分化和功能上相互拮抗，在再生障礙性貧血的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞是具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞，可抑制T細(xì)胞的活化和增殖，F(xiàn)oxp3是Treg的轉(zhuǎn)錄因子，控制Treg細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育和成熟及Treg細(xì)胞功能的發(fā)揮，再生性障礙貧血患者外周血和骨髓Foxp3表達(dá)均顯著降低[8]。體內(nèi)未知抗原可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞偏移分化，而Th2細(xì)胞代償不足，導(dǎo)致Th1/Th2比例升高，最終導(dǎo)致下游效應(yīng)因子和效應(yīng)細(xì)胞顯著升高，造成骨髓造血功能衰竭[9]。Th17細(xì)胞可分泌特異性細(xì)胞因子IL-17，功能上與Treg細(xì)胞相拮抗，在機(jī)體免疫防御和穩(wěn)定維護(hù)中發(fā)揮重要作用，Th17/Treg失衡參與再生障礙性貧血的發(fā)病，患者Th17細(xì)胞數(shù)量增多且與Treg細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，治療緩解者Th17細(xì)胞表達(dá)較治療前顯著降低[10]。

骨髓微血管系統(tǒng)生成與造血微環(huán)境密切相關(guān)，造血微環(huán)境改變是再生障礙性貧血病理生理變化的重要環(huán)節(jié)，bFGF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性，是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的生長(zhǎng)因子之一，且是特異性促進(jìn)新生血管形成的生成因子，骨髓bFGF水平與再生障礙性貧血的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。VEGF是作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一，在維持血管密度方面發(fā)揮積極作用，MVD改變和VEGF下調(diào)對(duì)再生障礙性貧血的病理生理過(guò)程有協(xié)同作用，再生障礙性貧血患者骨髓MVD、VEGF顯著降低，且與病情緩解程度呈正比[12]。

中醫(yī)無(wú)“再生障礙性貧血”之病名，多根據(jù)其貧血、發(fā)熱、衄血等臨床癥狀歸于“虛勞”“虛損”“血虛”“血證”等范疇，認(rèn)為其發(fā)病臟腑主要為心、肝、脾、腎，其中又以腎為根本，“腎主骨生髓”，“腎藏精”，“精血互化”，腎精虧虛，骨髓失于充養(yǎng)，不能化生氣血，而見(jiàn)面色萎黃、唇甲淡白、心悸、氣短、乏力，腦失滋養(yǎng)而見(jiàn)耳鳴、頭暈、健忘，骨髓空虛，腰府失養(yǎng)，而見(jiàn)腰膝酸軟，氣虛無(wú)力推動(dòng)血脈運(yùn)行，血虛則血行不暢，而致血瘀，或離經(jīng)之血不去，瘀阻絡(luò)脈，而見(jiàn)皮膚瘀斑或瘀點(diǎn)，離經(jīng)之血謂之壞血，其色紫暗，瘀血不去，新血不生，故病情纏綿難愈，所以腎精虧虛、氣血不足、瘀血內(nèi)阻是再生障礙性貧血的重要病機(jī)，治宜補(bǔ)腎生血，活血化瘀。本研究采用自擬補(bǔ)腎生血湯方中制首烏、熟地、女貞子、當(dāng)歸、阿膠、鹿角膠滋陰補(bǔ)血，填精生髓；菟絲子、仙靈脾、補(bǔ)骨脂、巴戟天溫補(bǔ)腎陽(yáng)；黨參補(bǔ)氣；丹參、茜草活血化瘀、生血止血，補(bǔ)血不留瘀、行血而不傷正；諸藥合用可兼補(bǔ)腎陰、腎陽(yáng)，填精益血，祛瘀生新。胡令彥等[13]研究顯示，補(bǔ)腎中藥可調(diào)節(jié)免疫功能紊亂，保護(hù)血細(xì)胞，刺激骨髓造血功能。孫鳳等[14]研究顯示，補(bǔ)腎生血中藥可協(xié)調(diào)Th17細(xì)胞mRNA表達(dá)水平，調(diào)整異常免疫反應(yīng)，恢復(fù)骨髓的造血細(xì)胞。董玢等[15]研究顯示，補(bǔ)腎生血中藥可激活EPO/EPOR信號(hào)途徑，抑制Th1活化誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，恢復(fù)骨髓造血干細(xì)胞功能。

本研究結(jié)果顯示，研究組治療后CD8+、CD4+、CD4+CD25+FoxP3+、CD3+CD4+INF-γ+、CD3+CD4+IL-4+、Th1/Th2、血常規(guī)和骨髓象改善情況均明顯優(yōu)于對(duì)照組，骨髓bFGF、MVD和VEGF水平高于對(duì)照組。結(jié)果說(shuō)明補(bǔ)腎生血湯聯(lián)合間充質(zhì)細(xì)胞治療再生障礙性貧血可調(diào)整機(jī)體免疫功能紊亂和改善骨髓造血微環(huán)境，詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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