益脾養(yǎng)肝方對(duì)肝癌前病變大鼠血清IL-6、TNF-α的影響

李京濤，魏海梁，閆曙光，郭 輝，鞠 迪，史曉燕，常占杰

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000)

肝癌是臨床常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，其具有發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、病死率高等特點(diǎn)，臨床上以手術(shù)治療為主、放化療結(jié)合為輔的綜合治療雖然有一定療效，但仍然存在預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)。肝癌前病變是指從肝硬化發(fā)展成為肝癌的中間階段，肝細(xì)胞的重度非典型腺瘤樣增生和變異肝細(xì)胞結(jié)節(jié)與肝癌的發(fā)生關(guān)系最為密切，若能提前干預(yù)肝癌前病變的發(fā)展，將可逆轉(zhuǎn)肝癌的發(fā)生[1-2]。前期研究顯示，益脾養(yǎng)肝方可能具有預(yù)防肝癌前病變的作用[3-4]，但其機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)觀察了益脾養(yǎng)肝方對(duì)二乙基亞硝胺(DENA)誘導(dǎo)的肝癌前病變大鼠肝功能、血清炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平及組織病理學(xué)的影響，旨在探討該方的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，均購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(軍)-2012-0007，飼料購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和藥品 DENA(0.95 g/mL，美國(guó)Sigma公司)；IL-6和TNF-α試劑盒(南京森貝伽生物有限公司)；益脾養(yǎng)肝方：由白術(shù)、黨參、熟地、鱉甲、枸杞、半枝蓮、郁金、姜黃、白花蛇舌草組成，藥材均統(tǒng)一由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥劑科購(gòu)買并制備成凍干粉，每克凍干粉的生藥含量為5 g,4 ℃冰箱密封保存，需要時(shí)以100 ℃沸水溶解，配制成大劑量濃度為1.0 g/mL、小劑量濃度為0.5 g/mL的中藥藥液。

1.3動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 將80只喂養(yǎng)1周的 Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、益脾養(yǎng)肝方小劑量組、益脾養(yǎng)肝方大劑量組，每組20只。除空白組外，其余組均給予DENA(0.5 mL/100 g)腹腔注射，2次/周(即1次/84 h)， 50 mg/(kg·周)，連續(xù)給藥至16周；在此過(guò)程中，益脾養(yǎng)肝方小、大劑量組分別給予0.5 g/mL和1.0 g/mL益脾養(yǎng)肝方灌胃，空白組、模型組給予生理鹽水灌胃，均10 mL/kg，1次/d，第16周灌胃24 h后處死大鼠。

1.4取材及指標(biāo)測(cè)定 處死大鼠前稱體質(zhì)量。采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，心臟采血注入2支EDTA管中，將血標(biāo)本分為2份，一份送陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生化檢驗(yàn)科檢測(cè)肝功能指標(biāo)(ALT、AST、GGT)，另一份離心后提取血清用于檢測(cè)IL-6、TNF-α水平(按照ELISA試劑盒說(shuō)明操作)；再解剖腹腔，完整取出肝臟，分別于肝左葉、右葉、尾葉取材并置于4%甲醛溶液中固定,常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以方差分析進(jìn)行組間比較，方差齊者采用單因素方差分析中的LSD進(jìn)行檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane's T2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清ALT、AST、GGT水平比較 模型組ALT、AST、GGT水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和益脾養(yǎng)肝方大劑量組ALT、AST、GGT水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且益脾養(yǎng)肝方大劑量組ALT、AST、GGT水平均明顯低于小劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、GGT水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與益脾養(yǎng)肝方小劑量組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 模型組血清IL-6和TNF-α水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和益脾養(yǎng)肝方大劑量組血清IL-6和TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且益脾養(yǎng)肝方大劑量組血清IL-6和TNF-α水平均明顯低于小劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與益脾養(yǎng)肝方小劑量組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟組織病理表現(xiàn) 空白組大鼠肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞排列比較整齊，圍繞著中央靜脈形成“輻輳”樣分布，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞漿均勻紅染，胞核居于中央，核膜完整，肝小葉內(nèi)未見(jiàn)明顯異常成分存在，匯管區(qū)動(dòng)靜脈、小膽管結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞水腫和炎癥細(xì)胞向肝臟實(shí)質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)。模型組大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞水腫變形，胞內(nèi)脂肪沉積，局部肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，匯管區(qū)膽管擴(kuò)張，膽汁淤積，同時(shí)毛細(xì)膽管大量增生；肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞核體積腫大，伴見(jiàn)細(xì)胞核分裂呈多形性，同時(shí)伴有異型增生和結(jié)節(jié)形成，排列紊亂，增生膠原纖維條索破壞形成假小葉，淋巴細(xì)胞向肝竇內(nèi)和匯管區(qū)移行。益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組肝細(xì)胞異型增生和核分裂相均較模型組減少，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞很少發(fā)生變性和壞死，淋巴細(xì)胞向匯管區(qū)和肝竇內(nèi)的浸潤(rùn)顯著減少。見(jiàn)圖1～4。

圖1 空白組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖2 模型組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖3 益脾養(yǎng)肝方小劑量組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖4 益脾養(yǎng)肝方大劑量組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

3 討 論

肝炎到肝癌的形成過(guò)程比較漫長(zhǎng)，而肝癌前病變是從肝硬化發(fā)展為肝癌之間一個(gè)不可逾越的過(guò)程，如果能夠提前阻止肝癌前病變的形成過(guò)程，可延緩或阻斷病情發(fā)展，顯著降低肝癌的發(fā)生率。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中對(duì)肝癌前病變雖沒(méi)有明確的概念，但中醫(yī)自古有“既病防變”的理念。益脾養(yǎng)肝方是我院沿用多年的中藥復(fù)方，方中熟地黃補(bǔ)腎滋陰，枸杞益陰養(yǎng)肝；白術(shù)健脾益氣；黨參補(bǔ)中益氣生血，助運(yùn)脾胃，達(dá)到后天得養(yǎng)、血?dú)獾贸渲康?；郁金行氣化瘀，氣行則血行；姜黃合鱉甲散瘀行氣，消積散結(jié)；白花蛇舌草合半枝蓮消癰散結(jié)，清解熱毒。全方具有養(yǎng)肝健脾、活血行氣、解毒消炎之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)揮發(fā)油可提升小腸推進(jìn)率，降低胃內(nèi)殘留率，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)的功效[5]；而白術(shù)內(nèi)酯I可抑制黑色素瘤A875活性，可調(diào)整細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少腫瘤微血管的形成，起到抗腫瘤作用[6]。鱉甲活性多肽可抑制小鼠肝纖維化模型中肝功指標(biāo)、纖維化指標(biāo)的升高,促進(jìn)超氧化物歧化酶(SOD)、金屬基質(zhì)蛋白酶-1(MMP-1)的合成，進(jìn)而起到保護(hù)肝細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用[7]；半枝蓮可通過(guò)降低實(shí)驗(yàn)性肝癌組織中ADAM10陽(yáng)性表達(dá)率來(lái)抑制原發(fā)性肝癌形成[8]，而半枝蓮醇提取物可通過(guò)阻止NF-κB誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子IL-6、IFN-γ等的釋放，促進(jìn)肝臟谷胱甘肽的表達(dá)而發(fā)揮保肝作用[9]。白花蛇舌草揮發(fā)油可抑制HeGP2細(xì)胞活力，使細(xì)胞體積變小、變圓、核固縮、細(xì)胞內(nèi)空泡變多等，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[10]。白花蛇舌草總黃酮可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞株DNA復(fù)制，阻滯細(xì)胞增殖周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時(shí)其可抑制CLIC4蛋白的表達(dá)和TGF-β1介導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組ALT、AST、GGT水平均明顯高于空白組；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組ALT、AST、GGT水平均明顯低于模型組，且益脾養(yǎng)肝方大劑量組各指標(biāo)水平均明顯低于小劑量組；益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組大鼠肝臟病變明顯輕于模型組。提示益脾養(yǎng)肝方可改善肝功能，抑制肝癌前病變的進(jìn)展。

肝癌前病變的形成過(guò)程與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥性微環(huán)境在介導(dǎo)整個(gè)肝癌的形成過(guò)程中發(fā)揮著“推動(dòng)力”的作用，炎癥因子則是推動(dòng)肝臟炎癥反應(yīng)的有力“執(zhí)行者”。TNF-α作為促炎因子，可通過(guò)介導(dǎo)NF-κB途徑激活肝星狀細(xì)胞，同時(shí)NF-κB的活化可促進(jìn)IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β等的表達(dá)，起到放大炎癥反應(yīng)的作用[12-13]。IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活化，使Kupffer細(xì)胞受損和觸發(fā)炎癥反應(yīng)[14]；且IL-6與IL-6Ra結(jié)合使PI3K活化，PIP2被磷酸化為PIP3，其通過(guò)間接或直接途徑激活A(yù)kt，進(jìn)而促進(jìn)肝癌進(jìn)展[15-16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯增高，益脾養(yǎng)肝方小劑量組和大劑量組血清IL-6和TNF-α水平均大幅降低，且大劑量組明顯低于小劑量組。提示益脾養(yǎng)肝方可抑制肝臟炎癥反應(yīng)。

綜上所述，益脾養(yǎng)肝方可抑制肝癌前病變的進(jìn)展，其可能是通過(guò)降低炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平，繼而發(fā)揮抑制肝臟炎癥反應(yīng)，降低炎性微環(huán)境對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)刺激作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)為益脾養(yǎng)肝方在臨床推廣應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1] 閆亞南,王寧,王卓昱,等. 直接灸“肝俞”對(duì)原發(fā)性肝癌癌前病變大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J]. 針刺研究,2016,41(4):321-326

[2] 宋藝君,楊史軍,王湘,等. 丹皮酚對(duì)二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌前病變的預(yù)防作用[J]. 陜西中醫(yī),2015，36(9):1270-1271

[3] 南然,宋春榮. 常占杰教授用益脾養(yǎng)肝法治肝病經(jīng)驗(yàn)談[J]. 光明中醫(yī),2012,27(12):2408-2409

[4] 李京濤,郭師,席奇,等. 益脾養(yǎng)肝方聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療原發(fā)性肝癌的療效觀察[J]. 陜西中醫(yī),2015，36(8):944-945

[5] 陳鎮(zhèn),夏泉,黃趙剛,等. 白術(shù)揮發(fā)油對(duì)小鼠胃腸功能的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2009,15(8):66-68

[6] 潘利文,宋捷. 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ體內(nèi)外的抗黑色素瘤研究[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2015,35(8):682-685

[7] 孔菲菲. 鱉甲活性多肽的制備工藝及其抗肝纖維化的藥效學(xué)研究[D]. 武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué),2014

[8] 康志強(qiáng),李平,段剛峰. 半枝蓮對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌組織中ADAM10表達(dá)的影響[J]. 腫瘤,2013,33(10):879-883

[9] 牛成偉,季莉莉,王崢濤. 半枝蓮對(duì)黃藥子肝毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào),2016，51(3):373-379

[10] 王麗麗,林婧,蔡巧燕,等. 白花蛇舌草揮發(fā)油對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用[J]. 福建中醫(yī)藥,2013,44(3):60-61

[11] 王秋蘭,薛永杰,韓濤. 胃癌中CLIC4蛋白表達(dá)及白花蛇舌草總黃酮對(duì)其表達(dá)的影響[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016,32(6):681-684

[12] 賈玉杰,趙芳,張彩華,等. 中藥肝復(fù)康對(duì)TNF-α介導(dǎo)的炎癥性肝損傷和大鼠肝纖維化的抑制作用[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2016,28(2):146-150

[13] 劉萍. TNF-α在肝衰竭疾病中作用的研究進(jìn)展[J]. 湖南中醫(yī)雜志,2016,32(9):188-190

[14] 周畢軍,趙巖,黃川鋒. 鬼針草水提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)肝損傷小鼠腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6的影響[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志,2016,36(12):2858-2859

[15] Rose-John S. IL-6 trans-signaling via the soluble IL-6 receptor:importance for the pro-inflammatory activities of IL-6 [J]. Int J Biol Sci,2012,8(9):1237-1247

[16] Hammerich L,Tacke F. Interleukins in chronic liver disease: lessons learned from experimental mouse models[J]. Clin Exp Gastroenterol,2014,7:297-306