補腎通絡(luò)方對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響

楊 帆，袁 芳，侯秀娟，朱躍蘭*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）是臨床上常見的一種漸進(jìn)性、退行性關(guān)節(jié)病變[1-2]。OA發(fā)病的具體機制尚不是十分明確，對OA的治療只能局限于對癥處理。目前對OA的發(fā)生機制主要認(rèn)為是關(guān)節(jié)表面的軟骨組織遭到破壞[3-4]。本研究通過運用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測補腎通絡(luò)方對KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的MMP-3/13和TIMP-1的mRNA水平及ADAMTs-4蛋白表達(dá)情況，在分子生物學(xué)層面探討本方治療KOA的相關(guān)作用機制，為其應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 普通級Wistar大鼠42只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由北京斯貝福生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心的普通環(huán)境中，恒溫恒濕，水瓶給水，自由進(jìn)食，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要藥品、試劑和儀器 主要藥品：美洛昔康片（7.5 mg/片，購自于上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20090789），抗骨增生膠囊（0.35 g/粒，購自于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z10980006），補腎通絡(luò)方（原藥材每劑含量：骨碎補9 g，桑寄生15 g，川牛膝12 g，雞血藤15 g，白芍12 g，穿山龍15 g，川芎10 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房提供，制成顆粒后每付藥質(zhì)量為10 g）。

主要試劑：木瓜蛋白酶（25 g/瓶，北京索萊寶科技有限公司提供），UltraPure Agarose、SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄kit（ABI-invitrogen提供），Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP（MDL提供，MD2142），Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP（MDL提 供，MD2141）， 寡核苷酸引物oligo（dt）和逆轉(zhuǎn)錄酶RTase（購自于GIBCO公司）等。

主要儀器：低溫高速離心機5810R（Eppendorf AG公司產(chǎn)品），核酸濃度測定儀（THERMO公司產(chǎn)品），ABI 7900 Q-PCR儀（Applied biosystems公司產(chǎn)品），電泳儀和凝膠成像儀（biorad公司產(chǎn)品）等。

1.3 各基因引物設(shè)計 Real-time PCR檢測目的基因引物，以下引物均在北京Invitrogen公司合成。見表1。

表1 各基因引物序列

2 實驗方法

2.1 模型復(fù)制 參照文獻(xiàn)[5]方法配制4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液，每次于大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 mL/肢，分別于造模的第1、4、7天進(jìn)行注射，方法與劑量相同，共3次。正常組大鼠不注射任何溶液。2.2 分組及給藥 購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周再制備KOA模型。模型制備成功后按照隨機數(shù)字表法將42只Wistar大鼠隨機分為7組，分別為正常組（I）、模型組（II）、西藥組（III）、成藥組（IV）、中藥低劑量組（V）、中藥中劑量組（VI）和中藥高劑量組（VII），每組分別為6只。造模成功后第2天即可開始給藥，正常組及模型組大鼠均給予蒸餾水灌胃10 mL/kg。根據(jù)大鼠與人的體表面積比值進(jìn)行換算后[6]，西藥組大鼠給予0.781 3 mg/kg的美洛昔康制成的混懸液灌胃，成藥組大鼠給予0.546 9 g/kg的抗骨增生膠囊制成的混懸液灌胃，中藥低、中、高劑量組分別予0.52 g/kg、1.04 g/kg、2.08 g/kg的補腎通絡(luò)顆粒制成的混懸液灌胃。灌胃給藥1次/d，連續(xù)4周。

2.3 RT-PCR測定方法 依據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法，取膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)股骨內(nèi)外側(cè)髁及脛骨平臺退變區(qū)的軟骨約10 mg置于Trizol液1 mL中勻漿，加入氯仿200 μL混勻，1 400 r/min 離心15 min。取上清加入等體積異丙醇，12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入75%乙醇混勻，10 000 r/min離心5 min。棄上清，用50 μL無菌DEPC處理過的三蒸水溶解沉淀以完成總RNA的提取。之后進(jìn)行擴增條帶：95 ℃預(yù)變性2 min，將PCR反應(yīng)溶液置于Real-time PCR儀上進(jìn)入40個PCR反應(yīng)，（94 ℃變性20 s；65 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s）；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder在2 %瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶，擴增產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳，紫外投射儀下觀察擴增產(chǎn)物特異條帶。為建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72 ℃緩慢加熱到99 ℃（每5 s升高1 ℃）。

2.4 Western blot測定方法 依據(jù)文獻(xiàn)[8]，取軟骨組織標(biāo)本置于研缽中加入少量液氮進(jìn)行研磨，再加入裂解液100 μL，冰上充分裂解30 min，4 ℃離心（1 200 r/min，15 min）取上清，離心反復(fù)3遍。用核酸蛋白檢測儀測定蛋白濃度，取300 μg總蛋白，加緩沖液，放入100 ℃水浴鍋中煮10 min使蛋白變性。配制10 %分離膠和4 %濃縮液，安裝電泳相關(guān)儀器，加入目標(biāo)蛋白10 μL，最后一個泳道加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker。電泳完畢后以半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉抗原1 h，加入含ADAMTs-4一抗（1:1 000稀釋）室溫孵育2 h后4 ℃過夜；次日洗膜后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1:35 000稀釋）室溫下孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光檢測雜交信號，X線片壓片曝光，凝膠圖像分析其積分光密度值。其中ADAMTs-4蛋白表達(dá)水平用β-actin蛋白表達(dá)量校正。

2.5 觀察指標(biāo) 1）一般狀態(tài)觀察：給藥干預(yù)期間觀察大鼠體質(zhì)量、精神狀態(tài)、活動、飲水及攝食情況。2）膝關(guān)節(jié)軟骨中mRNA和蛋白含量測定：分別用RTPCR法檢測軟骨中MMP-3、MMP-13和TIMP-1的mRNA表達(dá)；Western blot法檢測軟骨中ADAMTs-4蛋白水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。若符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；若非正態(tài)，采用非參數(shù)秩和檢驗（Mann-Whitney U），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量及一般狀態(tài)的影響比較 正常組大鼠狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，活動自如，飲水及進(jìn)食量適中，體質(zhì)量在給藥期間平穩(wěn)上升；其余各組大鼠在第一次造模后即出現(xiàn)雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)活動受限，主動活動量減少，不喜飲水進(jìn)食，毛發(fā)脫失、無光澤，體質(zhì)量減輕。造模成功后第2天開始給藥，在給藥基線期，各組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性；各組在給藥期間體質(zhì)量逐漸增加。見表2。

表2 各組大鼠給藥期間體質(zhì)量比較（ ，n = 5） g

表2 各組大鼠給藥期間體質(zhì)量比較（ ，n = 5） g

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別 給藥前 給藥后7 d 給藥后14 d 給藥后21 d 給藥后28 d I 240.54±8.40 300.74±19.96 358.67±26.52 413.95±30.28 415.03±41.20 II 158.04±14.35 203.44±28.21# 262.36±23.94# 318.40±19.16# 352.01±14.92#III 194.76±8.49 251.15±10.94#△ 306.32±11.13#△ 351.95±16.35#△ 365.87±12.60#△IV 193.01±15.02 250.57±14.33#△ 304.47±17.90#△ 350.89±19.21#△ 363.93±20.92#△V 179.92±18.65 234.65±25.11#△ 284.37±24.17#△ 335.61±26.97#△ 346.47±28.89#VI 187.83±9.12 241.64±15.89#△ 294.85±12.11#△ 346.71±10.56#△ 364.83±15.80#△VII 183.12±7.83 246.54±10.84#△ 282.95±24.13#△ 342.04±23.39#△ 356.79±26.40#

3.2 MMP-3、MMP-13和 TIMP1的 mRNA表達(dá) MMP-3、MMP-13和TIMP-1的相對定量，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析，可知其表達(dá)情況。對各組的2-△△Ct值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，見表3（插頁一）。MMP-3和MMP-13的mRNA表達(dá)情況是模型組最高（P＜0.05），正常組最低（P＜0.05），不同的藥物對其影響不同，其中補腎通絡(luò)方的中劑量組表達(dá)在各給藥組中最小，成藥組的表達(dá)在各給藥組中最大，補腎通絡(luò)方中劑量組與高劑量組相比，中劑量組低于高劑量組，然二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。TIMP-1的mRNA含量情況是在模型組中最低（P＜0.05），而在正常組中最多（P＜0.05），在各給藥組中補腎通絡(luò)方的高劑量組含量接近正常組，而低劑量組的表達(dá)最少。

3.3 ADAMTs-4的蛋白表達(dá) 以β-actin作為內(nèi)參，將ADAMTs-4的灰度值與β-actin的比值作為ADAMTs-4的相對表達(dá)量（見表4、圖2）：模型組中含量最高（P＜0.05），正常組中含量最低（P＜0.05），不同給藥組含量不同，成藥組最高而高劑量組最低，但之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組MMP-3/13和TIMP-1的mRNA表達(dá)的2-△△Ct值（ ，n = 5）

表3 各組MMP-3/13和TIMP-1的mRNA表達(dá)的2-△△Ct值（ ，n = 5）

注：與正常組相比，# P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05

組別 MMP-3 MMP-13 TIMP-1 I 0.06±0.01 0.25±0.04 2.82±0.32 II 1.00±0.26# 2.35±0.29# 0.18±0.02#III 0.49±0.10△ 0.55±0.12△ 0.64±0.10△IV 0.96±0.16 1.23±0.35△ 0.80±0.18△V 0.57±0.08△ 0.99±0.17△ 0.39±0.07 VI 0.13±0.01△ 0.32±0.03△ 0.88±0.24△VII 0.20±0.05△ 0.98±0.11△ 2.46±0.15△

表4 各組ADAMTs-4蛋白相對灰度值（ ，n = 5）

表4 各組ADAMTs-4蛋白相對灰度值（ ，n = 5）

注：與正常組相比，# P＜0.05

I II III IV V VI VII ADAMTs-4 0.47±0.13 0.67±0.09# 0.57±0.09 0.66±0.08# 0.60±0.14 0.58±0.15 0.56±0.11

圖2 各組軟骨中ADAMTs-4蛋白表達(dá)情況

4 討論

OA是以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的疾病。目前研究表明，OA不僅僅是單一的軟骨結(jié)構(gòu)病變，而是同時涉及軟骨下骨和滑膜的整個關(guān)節(jié)病變[9]。既往研究表明，OA的發(fā)生是由軟骨細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生蛋白水解引起的[10]。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是聚蛋白多糖，在疾病發(fā)展早期，ADAMTs-4是軟骨基質(zhì)蛋白聚蛋白多糖的主要降解酶，觀察關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTs-4蛋白的表達(dá)對疾病發(fā)展有一定的指導(dǎo)意義[11]。MMP-3/13是具有破壞軟骨組織中的主要成分II型膠原蛋白的作用[12]，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的降解。TIMP-1是由巨噬細(xì)胞合成的，對膠原酶和基質(zhì)水解酶有特異性的抑制作用。TIMPs具有除了抑制已經(jīng)激活的MMPs，還可阻止或延緩MMPs由酶原型向激活型轉(zhuǎn)變的作用[13]，對軟骨細(xì)胞具有保護作用，防治軟骨細(xì)胞發(fā)生或進(jìn)一步加重。

OA按中醫(yī)理論為“痹病”“骨痹”，肝腎虧虛、氣血不足是其本，風(fēng)寒濕邪侵襲、瘀血阻滯為其標(biāo)[14]，而補腎通絡(luò)方具有補益肝腎、強筋壯骨、活血化瘀、舒筋通絡(luò)，標(biāo)本兼治的功效。且前多項研究表明補腎通絡(luò)方對KOA治療有效[15-16]，但其具體的作用機制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，模型組MMP-3/13和ADAMTs-4的表達(dá)均明顯高于于正常組，驗證KOA大鼠軟骨因MMP-3/13和ADAMTs-4的影響受到破壞，參與軟骨退行性改變的過程，而各給藥組其含量均有不同程度的降低，總體以補腎通絡(luò)方含量較低，表明補腎通絡(luò)方具有保護軟骨的作用，ADAMTs-4的表達(dá)在各給藥組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能由于樣本量較小，導(dǎo)致數(shù)據(jù)統(tǒng)計差異無統(tǒng)計學(xué)意義；TIMP-1的表達(dá)是在模型組最低，而經(jīng)過給藥干預(yù)后，其含量有所升高，且在各給藥組中補腎通絡(luò)方高劑量組含量接近正常組，而在低劑量組表達(dá)最少，可說明藥物的干預(yù)能夠有效地增加TIMP-1的含量，保護軟骨細(xì)胞發(fā)生破壞，且濃度越高，保護作用越強。因此，補腎通絡(luò)方能夠明顯地降低MMPs和ADAMTs-4在軟骨中的表達(dá)，增加TIMP-1在軟骨中的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生、減少關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的破壞而起到保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。

綜述所述，MMPs和ADAMTs-4參與KOA的病理過程，通過早期應(yīng)用補腎通絡(luò)方治療KOA能夠顯著地降低MMPs和ADAMTs-4的表達(dá)，增加TIMP-1的表達(dá)，可以為KOA的治療提供新的理論依據(jù)。

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