正交試驗(yàn)優(yōu)選土茯苓提取液的澄清工藝

王冬梅，朱 偉，袁小紅，盧傳堅(jiān)*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510120；2. 廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)博士后科研流動站，廣州 510405）

土茯苓為百合科植物光葉菝葜(Smilax glabra Roxb.)的干燥根莖，性味甘平，具有解毒，除濕等功效，藥典記載用于濕熱淋濁，癰腫瘰疬，疥癬等[1]。土茯苓是皮膚科臨床內(nèi)外治法的常用中藥，尤其適用于嶺南地區(qū)的頑固、復(fù)發(fā)性皮膚病，如銀屑病等[2-7]，近年來課題組對土茯苓進(jìn)行了系列研究[8-11]。落新婦苷是藥典中土茯苓的指標(biāo)成分，黃杞苷也是其含量較大的活性成分[12]。中藥提取液傳統(tǒng)多采用水提醇沉法進(jìn)行澄清，醇沉需耗費(fèi)大量酒精，在除雜同時(shí)，極易造成有效成分丟失[13]。Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑是天然高分子化合物，能選擇性地除去藥液中的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等無需成分，提高有效成分的含量[14-15]。為更好地去除土茯苓提取液中的雜質(zhì)，同時(shí)最大程度保留藥材的指標(biāo)成分，實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑對土茯苓提取液的澄清工藝進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

Waters600E分析半制備高效液相色譜儀，包括 600四元梯度泵、2998 Photodide Arryay Detector、717 plus Autosample 和 Empower 工作站；Inertsil ODS-3色譜柱（北京迪馬）；Rotavapor R-215減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi），TC-15套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；MaxQ8000搖床（美國賽默飛） ；PHS-3C酸度計(jì)（上海精科）；U2901紫外雙光束分光光度計(jì)（日本日立）；EPOCH 超微量微孔板分光光度計(jì)（廣東云星科學(xué)儀器）；BS 224 S萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)）；XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備)；超聲波清潔器（上海波龍電子）；B600A醫(yī)用離心機(jī)(安新縣白洋離心機(jī)廠)；Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑（天津振天成科技，批號120726）；Milli-Q超純水(美國密理博)；色譜甲醇（瑞典歐普森）；甲酸（天津科密歐）；落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品（成都普瑞科技，批號：A100526）；黃杞苷（中國食品藥品檢定研究院，批號111906-201102）；土茯苓藥材購自康美藥業(yè)（批號110908801），經(jīng)廣東省中醫(yī)院袁小紅主任中藥師鑒定為百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 30% A→55% A，10～30 min 55% A→70% A，平衡時(shí)間15 min），流速0.8 mL/min，柱溫24 ℃，PDA檢測器采集范圍：190～400 nm，檢測波長290 nm。

2.2 供試品提取 取土茯苓飲片950 g置圓底燒瓶中，加入9 L體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，加熱回流3次，每次2 h，將醇提液混合，用紗布濾過，減壓回收乙醇，得250 mL粗提液，加去離子水定容至1 000 mL備用（即每毫升藥液含0.95 g原藥）。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取黃杞苷和落新婦苷對照品各2 mg，分別加2 mL甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL，再用甲醇稀釋成不同濃度倍數(shù)。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述不同濃度的兩種混合對照品溶液，高效液相色譜儀進(jìn)樣10 μL，以測得的響應(yīng)信號（峰面積）和濃度進(jìn)行線性回歸，得到落新婦苷的回歸方程：Y=37 844X+140 634（R=0.999 7），在3.13～200 μg/mL濃度線性良好。黃杞苷回歸方程：Y=18 372X+23 279（R = 0.999 9），在1.56～50 μg/mL濃度范圍線性良好。

2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取兩種對照品與供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，HPLC色譜圖見圖1A、1B。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定兩種對照品成分的峰面積，計(jì)算RSD。落新婦苷和黃杞苷RSD分別為1.4%和0.6%，表明儀器精密度良好。

圖1 A 落新婦苷和黃杞苷標(biāo)準(zhǔn)品（1.落新婦苷2.黃杞苷）

圖1 B 土茯苓提取液（1.落新婦苷2.黃杞苷）

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液分別于樣品制備后的0、3、6、12、18、24、48 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果處方中兩成分峰面積的RSD分別為1.8%和1.2%，表明48 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按2.2方法制備的供試品溶液1 mL，平行6份，分別按樣品-對照品（1:1）的比例加入一定量的混合對照品溶液，測定并計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD。結(jié)果顯示，落新婦苷和黃杞苷對照品的加樣回收率分別為102.6%和101.1%，RSD分別為1.4%和0.6%，表明此方法的準(zhǔn)確度較好。

2.9 澄清劑工藝考察

2.9.1 澄清劑的配制 Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑由A，B兩組分組成。A組分：精密量取1.0 g A組分中加入少量在蒸餾水，攪拌成糊狀，再加入蒸餾水配制至100 mL的黏膠液，溶脹24 h，用雙層紗布過濾即得。B組分：精密量取1.0 g B組分中加入少量體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液，攪拌成糊狀，再加體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液配制成100 mL的黏膠液，溶脹24 h，用雙層紗布過濾，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.9.2 澄清劑A、B加入順序?qū)Τs效果的影響 根據(jù)說明書，Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑主要是根據(jù)溶液的性質(zhì)選擇不同的添加順序，待實(shí)驗(yàn)處理的土茯苓提取液pH值為2.79，相對于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pH值4.8）為酸性環(huán)境，其添加順序?yàn)橄華后B組分，且先后加入的組分用量比為2:1。因此，確定澄清劑的加入順序?yàn)橄華后B，A組分用量為B組分2倍。

2.9.3 評價(jià)指標(biāo) 用澄清劑對土茯苓提取液進(jìn)行澄清處理時(shí)，既需最大限度的減少目標(biāo)有效成分的損失，又要保證較好的澄清效果。分別選取落新婦苷含量保留率（X1）、黃杞苷含量保留率（X2）、固形物去除率（X3）作為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，將落新婦苷保留率X1和黃杞苷保留率的權(quán)重定為0.7，固形物去除率X2權(quán)重定為0.3，即OD% =（0.7X1+0.7X2）/2+0.3X2。計(jì)算公式：落新婦苷保留率=澄清后提取液落新婦苷的含量/土茯苓提取液中落新婦苷的含量×100%；黃杞苷保留率=澄清后提取液黃杞苷的含量/土茯苓提取液中黃杞苷的含量×100%；固形物去除率=（澄清前固形物含量-澄清后固形物含量）/澄清前固形物含量×100%。

2.9.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。以澄清劑加入量，料液比，溫度，時(shí)間為考察因素，各選取最佳的3水平，以L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，按照“2.9.3”項(xiàng)的方法，計(jì)算落新婦苷和黃杞苷保留率及固形物去除率，進(jìn)行方差分析。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)方差分析表

2.9.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 由正交試驗(yàn)結(jié)果得出，澄清劑加入量A組分為2%，B組分為1%，料液比為1:10，溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間1 h，為Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑對土茯苓提取液最佳工藝條件，按照“2.3”項(xiàng)的方法，平行3次，計(jì)算落新婦苷和黃杞苷保留率及固形物去除率。

2.9.6 醇沉對照試驗(yàn) 量取料液比為1:10的土茯苓提取液 20.0 mL于250 mL錐形瓶中，緩慢加入4倍量無水乙醇，不斷混勻，密封，放入4 ℃冷庫靜置24 h，傾出上清液，離心，濃縮至10 mL，加去離子水定容至20 mL即為醇沉后的土茯苓提取液。按照上述條件及方法，計(jì)算落新婦苷和黃杞苷保留率及固形物去除率。

3 結(jié)果

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 由L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果的極差R可以看出，4因素對指標(biāo)成分落新婦苷和黃杞苷保留率的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋境吻鍎緯r(shí)間＞溫度；4因素對固形物去除率的影響順序?yàn)椋簻囟龋緯r(shí)間＞料液比＞澄清劑；料液比對綜合評分影響最大。由L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果(見表2）的方差分析可以看出，澄清劑加入量及提取液料液比對綜合評分有顯著影響，溫度和時(shí)間對提取液的澄清效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

溫度和反應(yīng)時(shí)間對落新婦苷和黃杞苷保留率無顯著性影響，而澄清劑又對固形物清除率有顯著影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，澄清劑A成分為2%時(shí)的土茯苓提取液澄清效果好，從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和節(jié)約時(shí)間、成本方面考慮，確定Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑澄清土茯苓提取液的最佳工藝條件為澄清劑加入量A組分2%，B組分為1% 料液比為1:10，溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間1 h。

3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.3 醇沉法成分保留率和固形物去除率 由表3看出，天然澄清劑組落新婦苷和黃杞苷保留率分別為98.71%和98.46%，比醇沉組保留更大比例的落新婦苷和黃杞苷，醇沉組固形物去除37.5%，是澄清組的兩倍多，天然澄清劑對土茯苓提取液的澄清在除雜的同時(shí)，保留更大比例的活性成分，用量少且節(jié)省時(shí)間，比傳統(tǒng)的醇沉法更有優(yōu)勢。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在建立HPLC方法測定供試品提取液中落新婦苷和黃杞苷含量的波長選擇上，據(jù)落新婦苷最大吸收波長為290.4 nm，黃杞苷為292.8 nm，兩者波長比較相近，因此檢測波長選擇290 nm。

實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水等流動相系統(tǒng)，結(jié)果以甲醇-0.1%甲酸水為流動相時(shí)顯示基線平穩(wěn)，且落新婦苷及黃杞苷分離效果好，故選擇甲醇-0.1%甲酸水為流動相系統(tǒng)。

課題組前期以多糖保留率和蛋白清除率為指標(biāo)，考察天然澄清劑純化土茯苓多糖研究中顯示80 ℃時(shí)，料液比1:15，提取2 h，A組分2%，B組分1%，多糖純化效果最好[16]。多糖為水溶性的極性大分子，析出需要相對較高的溫度且耗時(shí)略長，且易混入雜蛋白[9,17-20]。本實(shí)驗(yàn)采用4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化ZTC1+1Ⅱ型天然澄清劑對土茯苓提取液的澄清工藝，更以HPLC法精確顯示土茯苓指標(biāo)成分落新婦苷和黃杞苷澄清前后的含量變化，結(jié)果顯示，在最大保留落新婦苷和黃杞苷成分的同時(shí)，有效去除了蛋白、鞣酸等雜質(zhì)。同傳統(tǒng)醇沉法相比，節(jié)約大量乙醇試劑，不僅效率高且重要成分損失少。

綜上，本實(shí)驗(yàn)以正交試驗(yàn)研究Ⅱ型 ZTC1+1天然澄清劑對土茯苓提取液的最佳工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)化后工藝安全穩(wěn)定、簡單省時(shí)。

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