不同頻率電項針對PCPA致失眠大鼠睡眠時相及血清ACTH、CORT含量的影響

吳建麗，韓 璐，劉旭東，王永亮，張淑香，杜冬梅，王天琪，梅榮軍*

（1．黑龍江中醫(yī)藥大學針灸研究所，哈爾濱 150040；2．黑龍江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)院，哈爾濱 150001；3．黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040）

人類的睡眠和覺醒狀態(tài)是隨著晝夜周期的節(jié)律性而相互轉化的，良好的睡眠是促進機體生長、恢復精力和體力的重要環(huán)節(jié)。隨著生活節(jié)奏的加快和工作競爭壓力的增大，失眠的發(fā)病率不斷升高。調查表明，我國約有45.5%的人遭受失眠的困擾[1]。針刺被認為是臨床治療失眠行之有效的非藥物療法之一，其對失眠后腦電睡眠結構的修復及中樞神經(jīng)遞質、體內激素和肽類物質的內在調節(jié)機制一直是臨床和科研工作者的重要研究課題。有實驗研究表明針刺有促進睡眠的作用，其機制可能通過延長慢波和快動眼睡眠時間、增加睡眠深度來改善睡眠[2-3]，同時針灸還可以調節(jié)褪黑素、生長激素、皮質酮、睡眠誘導肽等激素和肽類活性發(fā)揮催眠作用，調整睡眠周期[4-5]。本實驗旨在通過PCPA法制備失眠大鼠模型，選用雙側項部腧穴結合不同頻率電針刺激干預失眠大鼠，觀察不同頻率電項針對失眠大鼠睡眠時相及血清ACTH、CORT含量的影響，探討電項針促眠的作用機制及不同刺激頻率電項針的療效差異。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康清潔級Wistar大鼠40只，雄性，9周齡，體質量（230±20）g，哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(黑)2013-001。實驗前適應性飼養(yǎng)1周，室溫保持在22 ℃左右，所用實驗大鼠的使用和喂養(yǎng)遵守動物保護協(xié)會的規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 4-氯-DL-苯基丙氨酸（Sigma公司進口的分裝，Maya化學公司），水合氯醛（天津市凱通化學試劑有限公司），大鼠ACTH、CORT ELISA試劑盒（南京建成生物研究所），VERSA max酶標儀（美國Molecular Devices公司），HHS21-6電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械廠），一次性針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司），牙科204型南韓打磨機（哈爾濱市道外區(qū)新世紀科學器材商），MedLab-U/4C501H生物信號采集系統(tǒng)（南京美易科技有限公司），6805-AⅡ型電針儀（汕頭市醫(yī)用設備廠有限公司）。

1.3 皮層電極埋置 參照文獻[6]埋置大鼠皮層腦電電極，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉大鼠（3 mL/100 g），用腦立體定位儀固定，剃除頭部毛發(fā)，碘伏消毒，剪開頭部皮膚充分暴露顱骨，用30%的雙氧水去除顱骨表面的脂類，充分暴露顱骨的冠狀縫和人字縫。用牙科打磨機分別在顱骨（AP-2，R2；AP+2，R2）鉆孔，用眼科鑷將2個直徑1 mm的眼鏡螺絲植入鉆孔內，使之接觸不要刺穿硬腦膜，作為皮層電極；在額骨正中（AP+5，R0）鉆孔，放入眼鏡螺絲作為接地電極，記錄腦電波形。所有螺絲術前制成微型3孔子母插座，電極用502膠水固定在顱骨上，然后縫合皮膚切口，連續(xù)3 d腹腔注射4萬U青霉素。術后單籠飼養(yǎng)，恢復7 d。

1.4 制備模型 埋置電極7 d后，除空白組外，采用PCPA腹腔注射法制備大鼠失眠模型[7]。造模前進食水12 h，于每日上午9:00開始抓取大鼠，在腹腔部緩慢注入PCPA混懸液，劑量為10 mL/kg，1次/d，連續(xù)2 d。28～30 h后模型形成。大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，對周圍聲音、光刺激敏感，興奮性增高，表明造模成功。

1.5 分組及處理 將40只大鼠隨機分成空白組，模型組，電項針1組、電項針2組、電項針3組，每組8只?？瞻捉M：正常飲水進食，自由活動每日均抓取稱重，固定四肢和軀干，保證同余下各組刺激相同，不做其他處理。模型組：造模前12 h禁食禁水，造模后恢復正常，每日稱重和固定，保證相同刺激條件，不做其他處理。電項針Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組：造模前12 h禁食禁水，造模后恢復正常飲食，每日電項針針刺30 min，連續(xù)治療7 d。所有大鼠在造模前1周進行埋置顱骨電極手術，在末次治療后描記腦電。

1.6 針刺治療方法 造模成功后第1天，除空白組和模型組，其余各組給予電項針治療，穴位選取大鼠項部雙側“風池” 穴和“供血” 穴。用0.25 mm×25 mm一次性毫針，直刺7～10 mm，連接電子脈沖治療儀，導線分別上下連接同側針柄，刺激頻率電項針Ⅰ組為2 Hz、電項針2組為50 Hz、電項針3組為100 Hz，針刺30 min。取穴方法參照《實驗針灸學》[8]。

1.7 指標檢測

1.7.1 腦電采集與分析 正式描記腦電的前一天將3孔微型插座的子母端連接，對大鼠進行適應性訓練，持續(xù)時間3 h。末次治療后在電磁屏蔽室對所有大鼠進行腦電描記，每只大鼠連續(xù)記錄腦電3 h。描記腦電前設置MedLab-U/4C501H生物信號采集系統(tǒng)參數(shù)，放大倍數(shù)200倍，上限頻率30 Hz，下限頻率2 s，采樣速度250 ms/div，勾選硬件50 Hz陷波，腦電清晰未見重疊。腦電分析采用目測法，以20 s為一分段單元進行睡眠分析，如一單元存有2種以上睡眠期，則以主導分期判斷為這一單元性質。根據(jù)大鼠腦電圖及有關文獻[9-10]標準，此睡眠周期包括覺醒期（wake，W）、慢波睡眠期（slow wave sleep，SWS）、快波睡眠期（fast wave sleep，F(xiàn)WS）3個睡眠時相，總睡眠時間（Total sleep time，TST）是SWS和FWS之和。

2 結果

2.1 電項針對大鼠睡眠時相的影響 從表1中可知，模型組大鼠SWS1、SWS2、FWS、TST各期時間與空白組比較均明顯減少，這表明制作失眠模型成功。各電項針治療組分別與模型組比較，其結果為：1）3個治療組對失眠大鼠SWS2、FWS、TST時間均有延長作用，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），電項針1組和2組對SWS1期的增加具有極顯著性意義（P＜0.01）；2）3個不同刺激頻率治療組比較，結果顯示電項針1組對各期睡眠時間的延長明顯優(yōu)于電項針2組和3組（P＜0.01）說明電項針改善睡眠作用隨著刺激頻率的增加而減弱，低頻刺激促眠作用有優(yōu)于高頻刺激的趨勢，低頻電項針恢復失眠大鼠睡眠節(jié)律的作用最強。

2.2 電項針對大鼠血清ACTH、CORT含量的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中ACTH和CORT含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，各電項針治療組血清中ACTH和CORT含量均降低，其中電項針1組和2組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。3個治療組之間比較，電項針1組ACTH和CORT含量改變優(yōu)于電項針2和3組（P＜0.01，P＜0.05）。（見圖1-2）

1.7.2 血清ACTH、CORT含量的測定 各組描記腦電后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，剪開腹部皮膚，迅速找到腹主動脈采血3～5 mL，置于離心管內，靜止20 min后，在低溫離心機上以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清也置于EP內，在-20 ℃冰箱保存待測。應用ELISA方法在VERSA max酶標儀上測定血清內ACTH、CORT的含量，試劑盒由南京建成生物研究所提供，嚴格按照說明書操作。

表1 不同頻率電項針對大鼠腦電圖睡眠時相的影響（x± s ，n = 8）

圖1 各組大鼠血清中ACTH含量比較（x± s，8只大鼠/組）

圖2 各組大鼠血清中CORT含量比較（x± s，8只大鼠/組）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學表明，失眠是由于大腦皮層的興奮與抑制功能失調而引起的以睡眠始發(fā)和睡眠維持障礙為臨床表現(xiàn)的一組疾病[11-12]。研究表明，失眠是導致內源性應激反應的一種重要因素，它能強烈興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）影響體內多種激素的水平，引起機體內分泌系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂從而產生諸多病癥[13-15]。西醫(yī)多采用苯二氮卓類藥物抑制大腦興奮性來治療失眠，但長期應用會出現(xiàn)成癮性、耐藥性、依賴性及反跳性失眠等不良反應[16-17]。

電項針療法是高維濱教授利用多年臨床經(jīng)驗結合現(xiàn)代解剖學理論創(chuàng)立治療腦源性疾病的新方法。高教授在仔細研究了項部“風池”和“供血”穴的解剖結構后，發(fā)現(xiàn)二穴下有與睡眠-覺醒密切相關的腦干網(wǎng)狀結構，通過針刺二穴并給予電流刺激，通過腦干上行激活系統(tǒng)使大腦皮層興奮性增強，恢復興奮與抑制過程的平衡，改善失眠狀態(tài)，調整覺醒-睡眠周期[18-19]。

研究表明，腦電波是判斷睡眠深度、反映睡眠各階段特征變化的一種有效手段，能客觀的記錄實際睡眠維持時間、睡眠效率、睡覺結構等客觀指標[20]。本實驗利用生物信號采集系統(tǒng)描記大鼠的睡眠腦電，分別觀察了正常大鼠、造模后大鼠及3種不同頻率治療組大鼠的腦電變化，并對結果進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，PCPA致失眠大鼠TST明顯減少，各頻率針刺組均能通過延長失眠大鼠SWS1、SWS2和FWS期來延長TST，并且調整睡眠各期的比例與正常大鼠相近，提示電項針對失眠大鼠的睡眠有改善作用；同時發(fā)現(xiàn)2 Hz頻率刺激組對各期睡眠時間的延長明顯優(yōu)于50 Hz和100 Hz，提示電項針促眠作用隨著刺激頻率的增加而降低，低頻刺激恢復失眠大鼠睡眠節(jié)律的作用最強。

睡眠是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我調節(jié)過程，與機體內分泌激素之間存在明顯的相關性。研究發(fā)現(xiàn)[21]，HPA軸激活可以促進ACTH、CORT的合成和分泌，提高大腦皮層應激性并維持覺醒狀態(tài)，這是引起失眠的重要原因。本實驗結果顯示，模型組大鼠血清ACTH、CORT含量明顯增多，說明造模后，影響了血清激素的分泌，是大鼠失眠的原因之一。經(jīng)過電項針治療后，3個治療組大鼠血清ACTH、CORT的含量均較模型組減少，說明電項針能抑制HPA的興奮，促進睡眠。同時本實驗通過比較2 Hz、50 Hz及100 Hz電項針刺激療效，發(fā)現(xiàn)2 Hz治療組大鼠血清ACTH、CORT含量降低的更為明顯，說明不同的刺激頻率治療失眠具有不同的效應差異，低頻電項針對睡眠的調節(jié)作用最好。

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