中藥鑒別方法與技術(shù)探究

魏曉楠，郝鐵成，劉慶華，謝國(guó)勇

(1. 衡水市冀州區(qū)醫(yī)院，河北 衡水 053200；2. 中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源學(xué)教研室，江蘇 南京 211198)

目前，中藥鑒定的方法主要有：來(lái)源(原植物、動(dòng)物和礦物)鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定和生物鑒定等方法。同時(shí)，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)中藥研究的加深，一些新方法新技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。

1 基源鑒定法[5]

中藥基源鑒定法是應(yīng)用植物學(xué)或動(dòng)物學(xué)或礦物學(xué)分類(lèi)知識(shí)，對(duì)中藥的來(lái)源進(jìn)行鑒定，確定其正確的學(xué)名，以保證在應(yīng)用中品種準(zhǔn)確無(wú)誤。

2 性狀鑒定法[6]

直觀性狀鑒定是一種經(jīng)驗(yàn)鑒別法，具有簡(jiǎn)單 、易行 、迅速的特點(diǎn) 。采用最直接的眼看、手摸、鼻聞、口嘗、或者水試、火試等十分簡(jiǎn)便的鑒定方法來(lái)鑒別中藥的品種、純度或質(zhì)量。關(guān)于中藥性狀方面的鑒別，近幾年出現(xiàn)了一些新的方法和技術(shù)，如中藥微性狀鑒定法[7]，電子鼻，電子舌，組織化學(xué)定位法等。

2.1 中藥微性狀鑒定法

中藥微性狀鑒定法是介于性狀鑒別和顯微鑒別之間的一類(lèi)新的鑒別方法，它是借助放大鏡、掃描儀、體視顯微鏡等儀器，觀察中藥材細(xì)微的外觀性狀以達(dá)到鑒別的目的，填補(bǔ)了肉眼和顯微鏡之間對(duì)性狀觀察的盲區(qū)，尤適用于花、果實(shí)、種子、葉、全草及動(dòng)物類(lèi)藥材。

2.2 電子鼻，電子舌

電子鼻又稱(chēng)仿生鼻或仿生嗅覺(jué)系統(tǒng)，是由選擇性的電化學(xué)傳感器陣列和適當(dāng)?shù)淖R(shí)別方法組成的儀器，能識(shí)別簡(jiǎn)單和復(fù)雜的氣味[8]，可得到與人的感官品評(píng)相一致的結(jié)果。它可以在幾小時(shí)、幾天甚至數(shù)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)地、實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)特定位置的氣味狀況，彌補(bǔ)人們憑借嗅覺(jué)對(duì)藥材的氣味特征進(jìn)行評(píng)定的某些缺陷。電子舌又稱(chēng)味覺(jué)芯片，味覺(jué)感受器或味覺(jué)感受系統(tǒng)[9]，它是模擬人的舌頭對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析、識(shí)別和判斷，用多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，快速地反映出樣品整體的質(zhì)量信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的識(shí)別和分類(lèi)。李文敏[10]等對(duì)電子鼻和電子舌技術(shù)在中藥加工炮制中的火候監(jiān)測(cè)方面及炮制成品外觀性狀質(zhì)量檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

2.3 組織化學(xué)定位法

組織化學(xué)定位(histochemistry)是建立在形態(tài)學(xué)之上的組織化學(xué)屬邊緣科學(xué)范疇，是研究細(xì)胞和組織中的化學(xué)組成、定位與定量以及代謝狀態(tài)的科學(xué)。中藥化學(xué)成分貯藏在特定的細(xì)胞和組織中，而這些化學(xué)成分是中藥防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)[11]，通過(guò)研究中藥活性成分在不同組織結(jié)構(gòu)中的分布，明確中藥性狀特征與質(zhì)量和藥效的關(guān)系，為性狀鑒別提供參考依據(jù)[12]。鐘霞君[13]等以廬山石韋和柔軟石韋營(yíng)養(yǎng)葉片為研究對(duì)象，運(yùn)用組織化學(xué)定位法研究皂苷類(lèi)化合物、蒽醌類(lèi)化合物及多糖物質(zhì)在不同組織中的分布情況，為合理開(kāi)發(fā)利用石韋資源提供參考依據(jù)。

此外，利用現(xiàn)代數(shù)碼、信息及計(jì)算機(jī)技術(shù)，中藥性狀鑒定技術(shù)與之結(jié)合，發(fā)展了一些新方法。如:中藥脈序圖譜鑒別法、中藥形態(tài)結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)三維重建與實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯示技術(shù)、仿生識(shí)別法等。肖小河[14]等以中藥附子為研究對(duì)象，進(jìn)行連續(xù)切片的三維重建與動(dòng)態(tài)顯示，為其鑒定提供了具有生動(dòng)性和立體感的三維圖像技術(shù)和資料。

本次評(píng)估工作，將評(píng)價(jià)目標(biāo)根據(jù)評(píng)估對(duì)象的特點(diǎn)劃分為二級(jí)評(píng)估指標(biāo)，一級(jí)評(píng)估指標(biāo)包含A建筑防火特性、B消防設(shè)施設(shè)備、C消防安全管理、D人員消防安全素養(yǎng)共4項(xiàng)，每項(xiàng)劃分為若干二級(jí)指標(biāo)，本次評(píng)估目標(biāo)共計(jì)劃分為18個(gè)二級(jí)指標(biāo)，如圖2所示。

3 顯微鑒定法

顯微鑒定技術(shù)(microscopical identification technology)是利用光學(xué)系統(tǒng)或電子光學(xué)系統(tǒng)設(shè)備，觀察肉眼所不能分辨的微小物體形態(tài)結(jié)構(gòu)及其特征的技術(shù)[15], 即利用顯微鏡對(duì)藥材及成方制劑組成藥味的組織、細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)含物等特征進(jìn)行鑒別，以此來(lái)鑒別制劑的處方組成以及藥材真?zhèn)?，具有?jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，是中藥檢驗(yàn)不可缺少的手段。它是一項(xiàng)專(zhuān)門(mén)的技術(shù)，需要以植(動(dòng))物解剖學(xué)、礦物晶體光學(xué)、植物顯微化學(xué)等知識(shí)作為基礎(chǔ)，以生物顯微制片技術(shù)、顯微鏡及其圖象描繪或攝影技術(shù)作為支撐。通常適用于性狀或理化鑒別不易識(shí)別的藥材，如多來(lái)源藥材、破碎或粉末藥材、以及粉末藥材制成的成方制劑的鑒定。中藥組成、中藥材來(lái)源是應(yīng)用顯微鑒定的先天條件，顯微特征可作為定性鑒別甚至有時(shí)可作為限量檢查標(biāo)準(zhǔn)、 顯微鑒定技術(shù)的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

(1) 熒光顯微鏡的應(yīng)用

細(xì)胞組織中自然存在的某些物質(zhì)可被激發(fā)產(chǎn)生熒光；某些物質(zhì)經(jīng)一定的化學(xué)處理，可轉(zhuǎn)化成熒光色團(tuán)，由此被誘發(fā)產(chǎn)生熒光；應(yīng)用含熒光色團(tuán)的物質(zhì)作為染料，使之與生物組織中和該物質(zhì)有特殊親和力的成分相結(jié)合，即可被激發(fā)熒光。因此，熒光顯微技術(shù)就是基于熒光對(duì)這類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行鏡檢的顯微光學(xué)觀測(cè)技術(shù)，熒光顯微鏡根據(jù)觀察物體的大小及原理可分為體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡等。它不僅能夠觀察到普通光學(xué)顯微鏡下藥材組織、細(xì)胞及內(nèi)含物所呈現(xiàn)的特征，還能夠直接顯示細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分，并且顯示的彩色效果很明亮，極易觀察，極易進(jìn)行定量分析，而且能以極低濃度的染料檢測(cè)出含量極微的物質(zhì)，從而為中藥真?zhèn)舞b定提供科學(xué)依據(jù)。

(2) 偏光顯微鏡的應(yīng)用

偏光顯微鏡又名極化顯微鏡、偏振光顯微鏡，它是利用自然光在通過(guò)各向異性透明體時(shí), 可產(chǎn)生偏振光的作用原理, 在普通光學(xué)顯微鏡中增加偏振裝置, 使得偏振光線在通過(guò)各向同性的樣品時(shí)呈現(xiàn)暗視野, 而各向異性的物質(zhì)呈現(xiàn)不同的色彩[16]。偏光顯微鑒別技術(shù)用于鑒別具有雙折性的物質(zhì)，適用于大多數(shù)植物類(lèi)、動(dòng)物類(lèi)及礦物類(lèi)藥材的鑒別。劉嶸[17]等利用偏光顯微鏡，對(duì)毛竹纖維細(xì)胞特征進(jìn)行定性分析后，并進(jìn)行了簡(jiǎn)單分類(lèi)，將竹纖維細(xì)胞分為3種類(lèi)型:Ⅰ型單厚壁型、Ⅱ型細(xì)胞和Ⅲ型多厚壁細(xì)胞，并將側(cè)方纖維帽分為3個(gè)區(qū)域，統(tǒng)計(jì)了各類(lèi)型纖維細(xì)胞在各區(qū)域內(nèi)的分布規(guī)律。

(3) 掃描電鏡的應(yīng)用

掃描電鏡是一種近年來(lái)發(fā)展迅速的電子光學(xué)儀器，樣品制備簡(jiǎn)單，分辨率高，可連續(xù)調(diào)節(jié)放大倍數(shù)，圖像立體感強(qiáng)，可清晰的觀察到物體表面亞顯微結(jié)構(gòu)，在中藥鑒定方面應(yīng)用較廣泛。掃描電鏡與其他儀器聯(lián)用，也發(fā)展了一些新的技術(shù)：掃描電鏡-X射線能譜儀聯(lián)用；掃描電鏡與電子微區(qū)分析儀聯(lián)用；掃描電鏡與掃描隧道顯微鏡聯(lián)用等。吳瑩[18]等利用掃描電鏡對(duì)中藥飲片浙貝母的真?zhèn)芜M(jìn)行了鑒別，發(fā)現(xiàn)與浙貝飲片相比，假藥模型呈表皮破裂，向外凸出，表皮及橫切面的淀粉粒已被提取出，均較少見(jiàn)。

(4) 數(shù)碼顯微成像技術(shù)

數(shù)碼顯微成像技術(shù)是數(shù)碼照相技術(shù)與顯微攝影技術(shù)相結(jié)合，一種觀察和記錄生物、物理和化學(xué)顯微材料的新技術(shù)。采用數(shù)碼相機(jī)拍攝的顯微圖片可以真實(shí)地反映鑒別對(duì)象的各種顯微特征。該技術(shù)快捷方便, 容易操作，在中藥顯微鑒定中已有應(yīng)用。數(shù)碼顯微成像技術(shù)使中藥材和粉末的顯微特征圖譜逐漸告別手繪圖形，2009年，出版了《中華人民共和國(guó)藥典中藥材顯微鑒別彩色圖鑒》[19]等大量彩色數(shù)碼顯微特征圖譜的專(zhuān)著。徐艷琴[20]等利用數(shù)碼顯微攝影技術(shù)對(duì)10省16個(gè)箭葉淫羊藿同質(zhì)園栽培居群的葉背非腺毛性狀進(jìn)行了比較研究。

4 理化鑒定

理化鑒別是利用某些物理的、化學(xué)的或儀器分析方法，分析中藥中所含的主要化學(xué)成分或有效成分，以此來(lái)鑒定中藥的真實(shí)性、 純度和品質(zhì)優(yōu)劣。一般理化鑒別常用的方法有沉淀法、顯色法、升華法、熒光法、結(jié)晶法等。

20世紀(jì)50年代，色譜和光譜技術(shù)在中藥理化鑒定中的應(yīng)用和推廣，使得理化鑒定的方法日趨完善。薄層色譜是最早應(yīng)用于中藥理化鑒定的，以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動(dòng)相，對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量。隨著色譜分離、分析技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜法、氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法和凝膠電泳等方法，能夠更準(zhǔn)確和精細(xì)地反映中藥中的化學(xué)成分和數(shù)量分布等特征，成為中藥鑒定和質(zhì)量控制的有效方法。一些聯(lián)用技術(shù)，如高效液相色譜-質(zhì)譜、紅外光譜-質(zhì)譜、質(zhì)譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜、高效毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜、氣相色譜-付里葉變換紅外光譜等是新技術(shù)的迅速發(fā)展和中藥理化鑒定方法不斷創(chuàng)新的結(jié)果。何丹[21]等建立液質(zhì)聯(lián)用對(duì)瑞香狼毒、狼毒大戟及月腺大戟3種狼毒藥材的來(lái)源進(jìn)行鑒定，從3種狼毒藥材提取物的液相色譜及質(zhì)譜圖中選擇18 個(gè)紫外吸收及質(zhì)譜響應(yīng)較好的色譜峰, 并對(duì)其定性, 可作為不同種屬狼毒藥材鑒別的特征峰。

此外，紫外、中紅外、近紅外、拉曼光、熒光光譜及等離子體光譜(ICP) 等光譜技術(shù)被大量成功應(yīng)用到中藥材和中藥飲片的鑒定研究中[22]，沈海龍[23]利用近紅外漫反射光譜法建立了準(zhǔn)確區(qū)分正品地骨皮和偽品荃皮、大青根皮的方法。

5 生物鑒定法

生物鑒定法是近年來(lái)興起的一種中藥品質(zhì)鑒定新方法，具有先進(jìn)性、適用性、可操作性和專(zhuān)屬性強(qiáng)等特征，并且能夠突出中藥的藥效學(xué)作用，準(zhǔn)確度高。它是對(duì)中藥所含化學(xué)物質(zhì)的生物效應(yīng)(藥效、活力或毒力) 測(cè)定或?qū)ι畔⑽镔|(zhì)(核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等) 的識(shí)別，以達(dá)到品質(zhì)鑒定目的的一種方法[24]。常見(jiàn)的有生物效應(yīng)鑒定法和基因鑒定法兩大類(lèi)，生物效應(yīng)鑒定法包括免疫鑒定法、細(xì)胞生物學(xué)鑒定法、生物效價(jià)測(cè)定法、單純指標(biāo)測(cè)定法等，基因鑒定法包括DNA 分子鑒定法、mRNA 差異顯示鑒定法等。

5.1 免疫鑒定法

免疫鑒定法是利用中藥含有的特異蛋白為抗原制備的特異抗體，與供試品中特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)的一種方法，可準(zhǔn)確的鑒別中藥品種。該技術(shù)適用于動(dòng)物藥材的鑒別，尤其是親緣關(guān)系比較接近的動(dòng)物藥間的鑒別[25]。丁培賢等[26]采用采用對(duì)流免疫電泳法及瓊脂免疫擴(kuò)散法準(zhǔn)確鑒定了虎、豹、猞猁、原貓、黃牛、豬等多種動(dòng)物的骨骼，并進(jìn)而將豹骨進(jìn)一步鑒定為金錢(qián)豹、云豹、雪豹。

5.2 生物效價(jià)測(cè)定法

生物效價(jià)測(cè)定法是測(cè)定藥物對(duì)生物機(jī)體某方面作用的強(qiáng)度的一種方法，常用的有抗菌效價(jià)、抗凝血活性、免疫作用、降壓物質(zhì)的測(cè)定、異常毒性、溶血與凝聚檢查法、過(guò)敏反應(yīng)檢查法等。王盛民等[27]建立了穿心蓮對(duì)照藥材對(duì)敏感菌株的劑量效應(yīng)曲線，并以穿心蓮對(duì)照藥材為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)穿心蓮藥材及含穿心蓮的中成藥進(jìn)行了生物檢定，表明方法可行。

5.3 細(xì)胞生物學(xué)鑒定法

細(xì)胞生物學(xué)鑒定法是通過(guò)對(duì)染色體進(jìn)行分類(lèi)，從而對(duì)中藥進(jìn)行鑒別的一種方法。中藥某個(gè)特定種屬的生物體細(xì)胞中的染色體形態(tài)和組型是固定不變的，根據(jù)其特定的細(xì)胞特征就可鑒定中藥的品種，該方法適用于果實(shí)及種子類(lèi)藥材。

5.4 單純指標(biāo)測(cè)定法

單純指標(biāo)測(cè)定法是測(cè)定某個(gè)藥物或者某類(lèi)藥物的某一特性或某一藥理作用強(qiáng)弱的方法。如對(duì)苦味中藥苦味指數(shù)的測(cè)定；使用溶血法鑒定柴胡和大葉柴胡；對(duì)含蒽醌類(lèi)成分大黃瀉下作用的測(cè)定等。

5.5 DNA分子鑒定技術(shù)

DNA分子鑒定技術(shù)主要是運(yùn)用分子遺傳學(xué)技術(shù)，如對(duì)雞內(nèi)金與鴨內(nèi)金的鑒別，可利用微量DNA提取技術(shù)，從測(cè)試藥材中提取DNA，進(jìn)行DNA堿基序列測(cè)定，從而鑒別出真?zhèn)?。中藥DNA分子鑒定以PFLP、PAPD和DNA barcoding技術(shù)為代表，形成了三大DNA鑒定技術(shù)：分子雜交信號(hào)、PCR擴(kuò)增指紋及核酸序列分析[28]。

5.6 蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)

蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)分為蛋白質(zhì)電泳鑒別技術(shù)、抗血清鑒別技術(shù)、同工酶鑒別技術(shù)和蛋白質(zhì)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)等。李明[29]利用過(guò)氧化物同工酶電泳方法，對(duì)當(dāng)歸及其混偽品歐當(dāng)歸、獨(dú)活進(jìn)行了鑒別。張燁[30]等利用蛋白芯片結(jié)合激光解析/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)羚羊角水溶液中的蛋白質(zhì)/肽成分進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析。

5.7 mRNA 差異顯示鑒定法

mRNA 差異顯示鑒定法是利用中藥不同組織和細(xì)胞在基因表達(dá)上的差異進(jìn)行鑒別的一種方法，采用該方法可鑒別栽培和野生、道地與普通藥材之間的特征，可廣泛用于中藥品種的鑒定。張西玲[31]等對(duì)當(dāng)歸、大黃種子中rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行了堿基序列測(cè)定，結(jié)果表明具有明顯的差異和可對(duì)比性。

中藥的歷史悠久，品種繁多，來(lái)源廣泛，產(chǎn)區(qū)分散，形態(tài)組織各異，化學(xué)成分多種多樣，只有對(duì)每種中藥進(jìn)行系統(tǒng)的比較和分析，掌握其本質(zhì)的鑒別特征，才能有效的區(qū)分和鑒別它們。隨著現(xiàn)代科學(xué)、網(wǎng)絡(luò)和信息技術(shù)的飛速發(fā)展，中藥的系統(tǒng)鑒別方法逐步趨于信息化和數(shù)據(jù)化，在“四大鑒別法”的基礎(chǔ)上，形成了一套以生物技術(shù)結(jié)合理化分析為重點(diǎn)，更為科學(xué)、完善和先進(jìn)的中藥鑒定理論，并不斷的推廣和市場(chǎng)化，推進(jìn)中藥事業(yè)的發(fā)展。