廣西壯藥薏苡葉丙酮提取物的體外抗氧化活性研究

黃鳳選，李建娜，黃鎖義，陸海峰

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)系，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 百色 533000; 3.廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000)

栽培薏苡(Coixlacryma-jobL.)屬于禾本科(Poaceae)玉蜀黎族(Trib.Maydeae)薏苡屬(Coix)。薏苡屬內(nèi)有多個種，起源并廣泛分布于東亞和東南亞地區(qū)。薏苡在東亞許多國家都是傳統(tǒng)的保健和藥用作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。在我國，薏苡不僅具有悠久的栽培歷史，還是分布最廣的藥用經(jīng)濟(jì)作物。近年來，人們發(fā)現(xiàn)了薏苡有防治癌癥的藥用價(jià)值，使薏苡的生產(chǎn)變得更加重要[5]。目前研究表明，薏苡中含有三酰甘油、薏苡內(nèi)酯、薏苡多糖、甾醇類化合物、茚化合物、三萜類化合物、生物堿類化合物及多種氨基酸和微量元素等[2]。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，目前國內(nèi)外對于薏苡的研究主要集中于薏苡仁上，對薏苡非種子部位的相關(guān)研究很罕見，限制了薏苡的深度開發(fā)和利用。因此，本試驗(yàn)采用超氧陰離子、DPPH自由基和Fe3+還原力的不同體外抗氧化模型，以其還原力和清除自由基能力為指標(biāo)，評價(jià)薏苡葉丙酮提取物的抗氧化活性，以期進(jìn)一步優(yōu)化薏苡的綜合利用價(jià)值，為加快薏苡藥品的臨床應(yīng)用和開發(fā)新型功能食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器JA2003電子天平

上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，編號SHP0700370133；HHS-11-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，編號150220131；TGL-16離心沉淀機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，編號501011；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；722N可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；722可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工有限公司，編號15071896。

1.1.2 材料與試劑

干燥過的廣西壯藥薏苡葉，采集于廣西百色市西林縣，粉粹后備用。

丙酮：成都市科龍化工試劑，批號 20110927；鄰苯三酚(焦性沒食子酚)：貴州遵義佳宏化工有限責(zé)任公司，批號080112；鹽酸：西隴化工股份有限公司，批號110725；無水乙醇：西隴科學(xué)股份有限公司，批號 1609011；十二水合磷酸氫二鈉：西隴化工股份有限公司，批號 20120809；磷酸二氫鈉：成都市科龍化工試劑廠，批號 20120604；三氯乙酸(TCA )：廣東光華科技股份有限公司，批號20131211；鐵氰化鉀：廣東汕頭市西隴化工廠； DPPH：梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司，批號 20130609；Tri-HCl 緩沖液、磷酸鹽緩沖液、蒸餾水：均為國產(chǎn)分析純。所用儀器均經(jīng)自來水清洗后蒸餾水潤洗晾干備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薏苡葉丙酮提取物的制備

精確量取粉粹后干燥的薏苡葉50 g于蒸餾燒瓶中，按料液比1∶16加入99.9%丙酮溶液后用玻璃棒攪拌均勻,于80 ℃恒溫水浴中加熱60 min，用SHB-III循環(huán)水式多用真空泵抽濾2次，每次都用適量的99.5%丙酮溶液沖洗，合并濾液。利用R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并后的濾液減壓濃縮至初始適量的10%，置于燒瓶中密封存于冰箱中60 min后制得薏苡葉丙酮提取物，同時(shí)制成不同濃度的薏苡葉丙酮提取物于冰箱中備用。

1.2.2 薏苡葉丙酮提取物對O2·清除能力

采用鄰苯三酚自氧化法[6]進(jìn)行測定。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下所示：精確量取質(zhì)量濃度為1 mol/L的Tri-HCl緩沖液(pH 8.0)4.0 mL于經(jīng)過干燥的具塞比色管中，放置于25 ℃水浴中預(yù)熱25 min，分別加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL，再在每個試管中加入質(zhì)量濃度為0.4 mmol/L鄰苯三酚(由10 mmol/L HCl制)2 mL，混合攪勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5min后立即加人 10 mmol/L 的HCl 2滴終止反應(yīng)，在320 nm處測定其吸光光度A，并用蒸餾水做空白對照管。

超氧自由基的清除率計(jì)算公式為：清除率(%)= [1-(A1-A2)/A3]×100%(A1為既加樣品又加入鄰苯三酚時(shí)的吸光光度；A2為加樣品但不加鄰苯三酚時(shí)的吸光光度；A3為只加鄰苯三酚卻不加樣品時(shí)的吸光度)。

1.2.3 薏苡葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力

精確量取質(zhì)量濃度為0.000 6 mol/L剛配置的DPPH溶液0.5 mL于10 mL的經(jīng)過干燥過的具塞比色管中，再在各比色管中加入不同濃度的樣品溶液2 mL，并用無水乙醇定容至5 mL，混勻后將比色管放于室溫暗光下反應(yīng)30 min，繼而在波長為517 nm處測定其吸光度A，以從高濃度逐漸稀釋的方式檢測不同濃度樣品對自由基的清除率，并以自由基清除率為50%時(shí)，樣品的濃度(IC50)來衡量樣品對自由基的清除能力。IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強(qiáng)。

DPPH自由基的清除率計(jì)算公式為：清除率(%) = [(A1-A 2)/A 1]×100%[A1為空白吸光度(反應(yīng)時(shí)間t= 0 min)，A2為反應(yīng)30min時(shí)的吸光度]。

1.2.4 薏苡葉丙酮提取物對Fe3+的還原能力

抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間存在聯(lián)系，抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)，藥物還原力的大小在一定程度上反映了其預(yù)防性抗氧化功能的強(qiáng)弱。因此，可通過測定還原力來說明抗氧化活性的強(qiáng)弱。采用普魯士藍(lán)法對Fe3+的還原能力進(jìn)行測定。在6支10 mL的具塞比色管中依次加入不同濃度的樣品溶液2.5 mL、2.5 mL磷酸鹽緩沖液[C(磷酸鹽溶液)=0.2 mol/L，pH6.6]和2.5 mL的1%鐵氰化鉀，混合攪勻后將各比色管置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min,然后加入2.5 mL的10%三氯乙酸，混合攪勻后在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min的離心沉淀機(jī)中將混勻后的溶液離心10 min，取上清液 2.0 mL，依次加入2.0 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵溶液(0.1%)振蕩搖勻,以試劑空白管做參照，在波長為700 nm下檢測其吸光度，且吸光度值增強(qiáng)表明還原能力增強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏苡葉丙酮提取物對清除能力

圖1 薏苡葉丙酮提取物對的清除效果

2.2 薏苡葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力

從圖2中可知，提取物濃度在0.4～2 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，隨著其濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也逐漸增加。在提取物的濃度為0.8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率超過IC50。由此得出結(jié)論，在一定的提取物濃度范圍內(nèi)，薏苡葉丙酮提取物對DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨著濃度的加大，清除率也跟著提高。

圖2 薏苡葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除效果

2.3 薏苡葉丙酮提取物對Fe3+的還原能力

由圖3可知，隨著薏苡葉丙酮提取物濃度的增加，吸光光度值也增大，表明薏苡葉丙酮提取物對Fe3+還原能力也逐漸增強(qiáng)。因此，在一定濃度范圍內(nèi)，薏苡葉丙酮提取物對Fe3+具有一定的還原能力。

圖3 薏苡葉丙酮提取物還原Fe3+能力的吸光度值

3 討 論

此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薏苡葉丙酮提取物對DPPH自由基及超氧自由基具有較好的清除能力，且對Fe3+具有一定的還原能力，從該實(shí)驗(yàn)中還可以看出，在一定的提取物濃度范圍內(nèi)，薏苡葉丙酮提取物的抗氧化作用與濃度呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，對鐵離子的還原能力也隨著提取物濃度的增加而增大。由此可知薏苡葉丙酮提取物具有良好的抗氧化活性，此實(shí)驗(yàn)通過對薏苡葉丙酮提取物抗氧化活性的研究，無疑為后期開發(fā)和利用薏苡葉提供更好的理論依據(jù)，加快實(shí)現(xiàn)對薏苡各部分的充分使用的目標(biāo)，而不只是簡單的食用薏苡種仁，卻只能將薏苡的其他部分丟棄，從而造成資料的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人體的許多疾病和組織損傷等與體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，如炎癥、腫瘤、衰老、血液病，以及心、肝、皮膚等各方面疑難疾病的發(fā)生機(jī)制與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除自由基能力下降有著密切關(guān)系[8]。研究表明，自由基的清除率是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)制[9]。因此，從天然食物中尋找高效、穩(wěn)定、低毒的抗氧化劑成為目前研究的一個熱點(diǎn)，其中藥用植物提取物是天然抗氧化劑的一個重要來源[1]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，植物提取物的抗氧化活性成分主要有多糖類化合物、黃酮類化合物、多酚類化合物、生物堿類、皂苷類、維生素類、多肽類等[3]，而廣西產(chǎn)薏苡葉中可能含有黃酮類、酚類、香豆素類、揮發(fā)油、植物甾類、糖類、苷類、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、生物堿等化學(xué)成分[12]，因此，其具有很高的研究價(jià)值與開發(fā)前景。