極地海洋真菌賽氏曲霉活性成分研究

劉洪成,曲振宏,姜洪芳,張鋒倫,石寶俊

(1.南京野生植物綜合利用研究院, 江蘇 南京211111；2.南京佳洪藥業(yè)有限公司,江蘇 南京210042)

海洋獨特的生態(tài)環(huán)境使其成為能產生新型結構先導化合物的重要生物來源，眾多的生物來源中又以海洋微生物為主力軍。海洋微生物的分布極其廣泛，而被人類分離和鑒定的海洋微生物種類少之又少，僅約占自然界總量的1%，基本上處于尚未被開發(fā)。不同于陸地微生物，海洋微生物生長在高鹽，高壓，寡營養(yǎng)，缺氧，缺少陽光等這一海洋特殊環(huán)境中，在其生長代謝過程中，能產生結構新穎并具有多種生物活性的次級代謝產物。此外，海洋微生物具備生長周期短、資源豐富多樣、適于大規(guī)模培養(yǎng)、受其他因素限制較小等優(yōu)勢。作為海洋微生物重要組成之一的真菌也一直成為大家的焦點，從真菌中開發(fā)出具有多重生物活性的新型藥物是解決目前藥物短缺的一個重要手段。

目前，真菌已經成為藥學領域研究較為透徹的微生物來源，從真菌中已經分離出了大量的生物活性物質，其中具有細胞毒性的物質包括大分子的多糖和蛋白質，還包括小分子的萜類、大環(huán)內脂類和生物堿類。據已有研究顯示，從賽氏曲霉中分離出的單體化合物具有顯著的細胞毒活性和抗腫瘤活性。 賽氏曲霉PFW-13的真菌從海南省?？谑邪咨抽T海灘浮游物質中分離出來，發(fā)酵產物顯示明顯的壞死細胞毒性活性和細胞周期抑制。通過活性追蹤方法，從六個吲哚、喹唑啉生物堿類似物中分離其活性位點。采用流式細胞術聯合形態(tài)學測定，MTT和SRB方法評估單體化合物的體外抗腫瘤活性。 在抗菌實驗中，化合物14-norpseurotin A、hydrohelvolic acid和helvolic acid對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、溶壁微球菌顯示不同的抗菌活性。

當前應用于臨床的藥物耐藥性不斷增強，不僅給醫(yī)生的治療帶來障礙，更是對病人身體極大傷害。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的醫(yī)院感染事件自1961年在英國首次報道以來，MRSA的檢出率逐年上升，從醫(yī)院檢出到社區(qū)檢出，可見其感染性極強，目前以其高致病性和多藥耐藥性被列為世界上最難解決的三大感染性頑疾之一。隨著NICU出現了首例MRSA感染患兒之后，MRSA成為了危重新生兒感染的一個主要原因，對新生兒家庭以及對社會造成了嚴重的負擔。耐藥菌的存在給整個社會帶來了嚴重的弊端，需要我們寄予重視，并且采取行之有效的方式解決，開發(fā)用于抑制臨床耐藥菌的新型結構先導化合物乃當務之急。

通過對實驗室中現有的23株真菌進行活性篩選，發(fā)現海洋真菌賽氏曲霉(Aspergillussydowii)活性較為顯著，結合現有對賽氏曲霉活性研究現狀，現擬從中篩選純化出最適用于抑制臨床耐藥菌的新型結構化合物。

1 實驗材料

1.1 土樣

南極長城站(62.22 °S, 58.96 °W)附近海域的海泥，于-40 ℃保存。

1.2 試劑

酵母提取物(英國OXOID), 胰蛋白胨(英國OXOID), 青霉素(上海生工生物工程技術服務有限公司), 鏈霉素(上海生工生物工程技術服務有限公司), 替加環(huán)素(大連美侖生物技術有限公司), 氟康唑(北京百靈威科技有限公司), 孟加拉紅培養(yǎng)基(生化試劑)(國藥集團化學試劑有限公司), RPMI 1640培養(yǎng)基(BIOFIL公司), 柱層層析硅膠(試劑級)(青島海洋化工廠分廠), 薄層層析硅膠(化學純)(青島海洋化工有限公司), 硅膠板(青島海洋化工廠分廠), ODS(Shimadzu公司), Sephadex LH-20(Pharmacia公司), 瓊脂糖(Agarose LE)(Genebase Gene-tech Co.,Ltd.), Premix STAR max(南京諾維贊生物科技有限公司), ITS1和ITS4(南京諾維贊生物科技有限公司).

1.3 儀器

超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司), GHX-9050B-1恒溫培養(yǎng)箱(恒溫搖床上海?，攲嶒炘O備有限公司), MLS-3751L高壓滅菌鍋(松下健康醫(yī)療器械株式會社), BioRad-T100 PCR儀(美國BioRad公司), TGL-16B 高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠), 高效液相色譜儀(JASCO公司), HiQ sil C18w分析色譜柱(Hanbon公司), HiQ sil C18-15半制備色譜柱(YMC公司) , AVANCE AV-500核磁共振儀(Bruker公司), 恒溫搖床(常州國華電器有限公司), 凝膠成像儀及分析系統(BioRad公司), 水平電泳槽(南京大學儀器廠), 高速臺式離心機(上海安亭), YY-4穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(南京新校園生物技術研究所), 酶標儀(BIO-RAD)。

1.4 培養(yǎng)基

大米培養(yǎng)基：大米100 g，海水晶30 g，無水硫酸鎂0.3 g，水1000 mL。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母提取物2.5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水500 mL，pH 7.0。

YPD液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水500 mL，pH 7.0。

1.5 抗性指示菌來源

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant stphylococcus aureus, MRSA)；耐甲氧西林表皮葡萄球菌(Methicillin-resistant stphylococcus epidermidis, MRSE)；大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 11229)；白色念珠菌(Candida albicans)。

2 實驗方法

2.1 菌株的分離純化

2.1.1 土樣處理

采用梯度稀釋法，向9 g極地土樣中加入90 mL無菌水，用玻璃珠充分攪拌混勻，吸取1 mL上清液加入9 mL的無菌水中，吹打均勻，以此濃度依次作10-1，10-2，10-3，10-4倍的梯度稀釋。

2.1.2 菌株分離

用移液器分別吸取500 μL 不同稀釋倍數的上清液，加入孟加拉紅固體培養(yǎng)基上，將上清液用無菌涂布棒均勻涂布在整個平板上。將平板倒置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d。

2.1.3 菌株純化培養(yǎng)

待長出單菌落后，根據三區(qū)平板劃線法，挑取單菌落，接種于孟加拉紅培養(yǎng)基中，將平板倒置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d。

2.1.4 保存菌株

待劃線后純化的菌落長成，挑取單菌落，接種于孟加拉紅斜面培養(yǎng)基上，放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d。待長出菌落后，加入無菌液體石蠟封藏，于-20 ℃冰箱保存。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 基因組DNA提取

基因組DNA提取按照真菌基因組DNA提取試劑盒(Sangon Biotech公司)進行。

具體操作步驟如下：

基因組DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳：加樣后于電壓100～120 V電泳，并于254 nm觀察，得到一條清晰、明亮的條帶。

2.2.2 rDNA-ITS序列擴增

以提取的真菌基因組DNA為模板，通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')為上、下游引物，如表1～2反應體系和反應步驟進行PCR。

表1 PCR反應體系

表2 PCR反應步驟

根據PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳結果(條帶清晰、明亮)，確定PCR產物結果與預PCR結果一致，可進行下一步測序操作。

2.2.3 擴增產物測序與系統進化樹的構建

移送專業(yè)測序公司測序。 將所測得的真菌 rDNA-ITS序列在GenBank數據庫中進行序列比對，并從數據庫中選取相似度高的菌株，用Clustal X軟件，進行多序列比對，然后用Mega4.1軟件中的鄰接法構建系統進化樹。

2.4 菌株的發(fā)酵和發(fā)酵產物的預處理

2.4.1 接種培養(yǎng)

選取一個平板，刮取6 g干燥孢子，稀釋到60 mL的無菌水中，搖勻，制成孢子懸液。

將該孢子懸液取1 mL接種到大米培養(yǎng)基中，放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)20 d。

2.4.2 大米培養(yǎng)基的處理

將培養(yǎng)20 d的大米培養(yǎng)基碾碎后，用2 L 95%乙醇超聲提取3次，提取液經過減壓濃縮得到65 g棕色浸膏，再將浸膏溶解于150 mL水中，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等體積分別萃取3次，減壓濃縮，得到7.23 g石油醚相，0.52 g氯仿相，1.06 g乙酸乙酯相，13.56 g正丁醇相。

2.5 SP-1次級代謝產物的分離

2.5.1 乙酸乙酯相的分離

采用ODS反相色譜柱對乙酸乙酯相(約1.06 g)進行分離。(1 BV=150 mL)，采用甲醇∶水為流動相進行梯度洗脫(20%→40%→60%→100%)，每個梯度洗脫4個柱體積。通過TLC分析，合并相同流分，得到4個組分：Fr.1(133.1 mg)，Fr.2(137.4 mg)，Fr.3(111.7 mg)，Fr.4(18.9 mg)。

采用硅膠柱層析，對Fr.2(137.4 mg) 進行分離。將Fr.2溶解后拌入0.3 g硅膠(100～200目)，烘干，稱取7 g硅膠H，作柱填料(1 BV=25 mL)。以氯仿∶甲醇(20∶1→15∶1→8∶1→4∶1→1∶1)為流動相，進行梯度洗脫。通過TLC分析，合并相同流分，得到5個組分：Fr.2-1(3.2 mg)，Fr.2-2(55 mg)，Fr.2-3(20.8 mg)，Fr.2-4(10.9 mg)，Fr.2-5(7.3 mg)。

采用硅膠柱層析，對Fr.3(111.7 mg)進行分離。將Fr.3溶解后拌入0.5 g硅膠(100-200目)，烘干，稱取10 g硅膠H，作柱填料(1 BV=30 mL)。采用氯仿∶甲醇(20∶1→15∶1→8∶1→4∶1→1∶1)為流動相，進行梯度洗脫。通過TLC分析，合并相同流分，得到5個組分：Fr.3-1(0.6 mg)，Fr.3-2(8.5 mg)，Fr.3-3(0.7 mg)，Fr.3-4(67.8 mg)，Fr.3-5(7 mg)

對Fr.3-4(67.8 mg)進行液相制備，以15%乙腈(0.1%甲酸)為流動相，以210 nm為檢測波長。得到化合物L-1(47.4 mg，出峰時間21 min)和L-2(6.7 mg，出峰時間26 min)，均為白色固體化合物。

對Fr.2-2(55 mg)進行液相制備，以15%乙腈(0.1%甲酸)為流動相，以210 nm為檢測波長，得到無色針狀結晶L-3(3.3 mg，出峰時間16 min)。

乙酸乙酯相的分離流程圖如圖1。

圖1 乙酸乙酯相的分離流程

2.5.2 正丁醇相的分離

采用ODS反相色譜柱，對正丁醇相(13.56 g)進行分離。(1 BV=150 mL)，采用甲醇∶水(10%→20%→40%→60%→100%)為流動相，進行梯度洗脫，每個梯度洗脫4個柱體積。通過TLC分析，合并相同流分，得到5個組分：Fr.1(350 mg)，Fr.2(421.8 mg)，Fr.3(111 mg)，Fr.4(167.9 mg)，Fr.5(121.5 mg)。

將正丁醇相Fr.1(350 mg)和乙酸乙酯相Fr.1(133.1 mg)合并，采用硅膠層析色譜柱對其進行分離。將樣品溶解后拌入1 g硅膠(100～200目)，烘干，稱取15 g硅膠H，作柱填料。(1 BV=40 mL)，采用氯仿：甲醇為流動相進行梯度洗脫(25∶1→18∶1→15∶1→10∶1→5∶1→3∶1→1∶1)，通過TLC分析，合并相同流分，得到12個組分：Fr.1-1(4.1 mg)，Fr.1-2(42.5 mg)，Fr.1-3(5.8 mg)，Fr.1-4(51 mg)，Fr.1-5(35.4 mg)，Fr.1-6(21.7 mg)，Fr.1-7(7.2 mg)，Fr.1-8(7.8 mg)，Fr.1-9(13.5 mg)，Fr.1-10(10.5 mg)，Fr.1-11(45.9 mg)，Fr.1-12(97.2 mg)。

Fr.1-5經過重結晶得到白色固體化合物，命名為L-4(10 mg)。Fr.1-9經過重結晶，得到無色針狀晶體，命名為L-5(4 mg)。

正丁醇相的分離流程圖如圖2：

圖2 正丁醇相的分離流程

2.5.3 氯仿相的分離

將氯仿相(0.52 g)以甲醇為流動相，經Sephadex LH-20分離。通過TLC分析，合并相同流分，得到9個組分：Fr.1(10.7 mg)，Fr.2(24.3 mg)，Fr.3(19.4 mg)，Fr.4(90 mg)，Fr.5(83.5 mg)，Fr.6(19.2 mg)，Fr.7(127.2 mg)，Fr.8(5 mg)，Fr.9(9.3 mg)。Fr.6經過重結晶，得到白色粉末化合物，命名為L-6(4.7 mg)。

對Fr.4(90 mg)采用硅膠柱層析進行分離。將Fr.4溶解后拌入0.4 g硅膠(100-200目)，烘干，稱取10 g硅膠H，作柱填料。(1 BV=30 mL)，采用氯仿：甲醇為流動相進行梯度洗脫(40∶1→35∶1→30∶1→25∶1→20∶1→15∶1→10∶1→5∶1→3∶1)，通過TLC分析，合并相同流分，得到8個組分：Fr.4-1(6.2 mg)，Fr.4-2(8.5 mg)，Fr.4-3(5.3 mg)，Fr.4-4(2.3 mg)，Fr.4-5(11.7 mg)，Fr.4-6(5.2 mg)，Fr.4-7(7.2 mg)，Fr.4-8(25.2 mg)。Fr.4-2經過重結晶，得到白色粉末狀化合物，命名為L-7(5.1 mg)。

氯仿相的分離流程圖如圖3：

圖3 氯仿相的分離流程圖

2.6 化合物的結構鑒定

運用現代波譜技術，對分離得到的單體化合物進行結構鑒定。將樣品化合物用相應的氘代試劑溶解，應用AVANCE AV-500核磁共振儀，得到其核磁共振波譜信息(1H-NMR,13C-NMR)。

2.7 化合物MIC值的測定

2.7.1 抗細菌MIC值的測定

以MRSA, MRSE, 大腸桿菌作為指示菌，將其凍存甘油管于37 ℃水浴活化后，以0.1%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)4～8 h，再用LB液體培養(yǎng)基進行稀釋，得到105 CFU/mL細菌懸液。

每組樣品設置10個濃度梯度，3個平行實驗。用LB培養(yǎng)基對高濃度樣品溶液進行稀釋，得到1 mg/mL樣品溶液，使溶劑含量小于1 %。向第1孔加入160 μL LB培養(yǎng)基，第2～10孔加入100 μL LB培養(yǎng)基，取40 μL濃度為1 mg/mL的樣品溶液加入第1孔，再依次對各孔進行2倍稀釋，使各孔濃度分別為200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39 μg/mL；再向各孔加入100 μL 105 CFU/mL菌懸液，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。陽性藥物為替加環(huán)素。以200 μL LB培養(yǎng)基為調零組，100 μL LB培養(yǎng)基和100 μL 菌液為空白對照組。以完全無菌生長的最低濃度，作為最低抑菌濃度(MIC)。

2.7.2 抗真菌MIC值的測定

以白色念珠菌作為指示菌，將其凍存甘油管于30 ℃水浴活化后，以0.1%接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h，再用RPMI 1640培養(yǎng)基進行稀釋，得到103 CFU/mL菌懸液。

每組樣品設置10個濃度梯度，3個平行實驗。用RPMI 1640培養(yǎng)基對樣品進行稀釋，得到1 mg/mL樣品溶液，使溶劑含量小于1%。第1孔加入160 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，第2～10孔加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，取40 μL濃度為1 mg/mL的樣品溶液加入第1孔，再依次對各孔進行2倍稀釋，使各孔濃度分別為200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39 μg/mL；再向各孔加入100 μL 103 CFU/mL菌懸液，30℃靜置培養(yǎng)24 h。陽性藥物為氟康唑。以200 μL RPMI 1640培養(yǎng)基為調零組，100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基和100 μL 菌液為空白對照組。以完全無菌生長的最低濃度，作為最低抑菌濃度(MIC)。

3 實驗結果

3.1 菌株的序列分析

以ITS1和ITS4作為擴增引物，得到的擴增產物長度為500～750 bp。將PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，得到結果與預期結果一致。將PCR產物送至專業(yè)測序公司(南京思普金生物科技有限公司)進行測序。

SP-1的rDNA-ITS測序結果如下：

CTTTATGTTGAACCTGTGGAAGGATCATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCTCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTATCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT

利用NCBI中的BLAST工具，將該測序結果上傳至GenBank數據庫，發(fā)現菌株SP-1的rDNA-ITS序列與賽氏曲霉(Aspergillussydowii)的序列相似性達到98%，選取部分相似性較高的菌株，構建系統進化樹如圖4所示，最終鑒定該菌株為賽氏曲霉。

圖4 SP-1的系統發(fā)育樹

3.2 單體化合物形態(tài)和結構解析

3.2.1 化合物L-1的結構解析

1H-NMR(500 MHz, in CD3OD) δ(ppm)：7.48(1H, dd,J=8.0, 1.0 Hz), 7.31(1H, d,J=8.0 Hz), 7.42(1H, d),1.65(3H, s), 1.39(2H, m), 1.38(2H, m), 1.37(2H, m), 1.15(3H, s), 1.14(3H, s)；

13C-NMR(500 MHz, in CD3OD) δ(ppm)：169.9(C), 156.9(C), 137.9(C), 131.7(C), 127.8(CH), 121.6(CH), 118.7(CH), 78.0(C), 71.4(C), 45.0(CH2), 29.2(CH3), 29.1(CH3), 29.0(CH3), 20.1(CH2) 。

化合物L-1為白色粉末狀。分子式為C15H22O5。1H-NMR 在6～8 ppm間顯示有三個芳香氫信號，在高場區(qū)有三個明顯的甲基信號，同時在高場區(qū)還存在三個明顯的亞甲基信號；13C-NMR顯示化學位移δ169.9說明有羰基的存在，156.9, 137.9, 131.7, 127.8, 121.6, 118.7顯示有6個SP2雜化的碳原子，結合氫譜可知其歸屬于芳香環(huán)的6個碳原子。

與文獻[16]比對， L-1的核磁數據與其報道的化合物8一致，因此確定L-1為hydroxysydonic acid。

3.2.2 化合物L-2的結構解析

1H-NMR(500 MHz, in CD3OD) δ(ppm)：7.48(1H, dd,J=8.0, 1.0 Hz), 7.41(1H, d,J=1.0 Hz), 7.30(1H, d,J=8.0 Hz), 3.99(2H, dd,J=10.5, 5.9 Hz), 3.30(2H, d,J=10.5 Hz), 2.00(2H, m), 1.85(2H, m), 1.64(3H, s), 1.55(1H, m), 1.39(2H, m), 1.35(2H, m), 1.20(2H, m),1.08(2H, m), 0.87(3H, d,J=6.5 Hz)；

13C-NMR(500 MHz, in CD3OD)：170.2(C), 157.1(C), 138.0(C), 132.1(C), 127.9(CH), 121.7(CH),118.8(CH), 80.5(CH2), 78.1(C), 43.9(CH2), 36.9(CH), 34.8(CH2), 29.0(CH3), 22.6(CH2), 17.1(CH3)。

化合物L-2為白色粉末。分子式為C15H22O5，其不飽和度為5。1H-NMR 顯示在6-8 ppm 間有一個芳香氫信號存在，在高場區(qū)顯示有甲基信號存在；13C-NMR顯示化學位移在170.2說明化合物中存在羰基，157.1, 138.0, 132.1, 127.9, 121.7, 118.8則歸屬于芳香碳原子。

通過與文獻[16]比對，L-2的核磁數據與其報道中的化合物2一致，因此確定L-2為12-hydroxysydonic acid 。

3.2.3 化合物L-3的結構解析

1H-NMR(500 MHz, in CD3OD) δ(ppm)：7.08(2H, d,J=8.5 Hz), 6.72(2H, d,J=8.5 Hz), 3.47(2H, s)；

13C-NMR(500 MHz, in CD3OD)：174.3(C), 156.0(C), 129.9(CH), 126.9(C), 114.8(CH), 39.8(CH2) 。

化合物L-3為無色針狀結晶。分子式為C8H8O3，其不飽和度為5。1H-NMR 顯示在6-8 ppm 間有兩種芳香氫信號存在，且為雙峰，化學位移分別為7.08(2H, d), 6.72(2H, d)，提示化合物可能存在對位二取代苯環(huán)結構，在高場區(qū)顯示亞甲基信號存在。13C-NMR顯示化學位移在174.3表明有羰基存在，化學位移在156.0, 129.9, 126.9 , 114.8則歸屬于芳香碳信號，化學位移顯示在39.8，則表示有飽和碳的存在。

通過與文獻[17]比對，L-3的核磁數據與其中報道的化合物2一致，因此確定化合物L-3為對羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid) 。

3.2.4 化合物L-4的結構解析

1H-NMR(500 MHz, in CD3OD) δ(ppm)：δ3.2(2H, t,J=6.9), 2.31(2H, t,J=7.4), 1.92(3H, s), 1.78(2H, m,J=7.1 Hz)；

13C-NMR(500 MHz, in CD3OD)： 176.9(C), 173.4(C), 39.8(CH2), 32.2(CH2), 25.8(CH2), 22.5(CH3)。

化合物L-4 為白色粉末。分子式為C6H11O3N。不飽和度為2。1H-NMR在高場區(qū)顯示有甲基信號的存在?；瘜W位移3.2(2H, t,J=6.9), 2.31(2H, t,J=7.4), 1.78(2H, m,J=7.1 Hz)顯示，為三個連接在一起的亞甲基信號，13C-NMR顯示有兩個羰基信號，其化學位移在176.9, 173.4。

通過與文獻[18]比對，L-4的核磁數據與其中報道的化合物7一致，因此確定化合物L-4為4-乙酰氨基丁酸(4-acetylaminobutanoic acid) 。

3.2.5 化合物L-5的結構解析

1H-NMR(500 MHz, in DMSO-d6) δ(ppm)：8.34(1H, s), 8.14(1H, s), 5.88(1H, d,J=6.2 Hz), 4.61(1H, q,J=5.6 Hz), 4.14(1H, d,J=3.1 Hz), 3.96(1H, d,J=3.2 Hz), 3.67(1H, m), 3.55(1H, m)；

13C-NMR(500 MHz, in DMSO-d6)：152.4(CH), 149.1(C), 119.3(C), 156.2(C), 139.9(CH), 87.9(CH), 73.4(CH), 70.6(CH), 85.9(CH), 61.7(CH2)。

化合物L-5為無色針狀結晶。1H-NMR在低場區(qū)顯示出一個亞甲基信號，其化學位移是7.32(2H, s)，顯示有2個活潑氫信號。13C-NMR顯示化學位移在152.4(CH), 149.1(C), 119.3(C), 156.2(C), 139.9(CH)，表明為芳香碳信號。

通過與文獻[19]比對，L-5的核磁數據與其報道中的腺嘌呤一致，因此確定化合物L-5為腺嘌呤(adenosine) 。

3.2.6 化合物L-6的結構解析

1H-NMR(500 MHz, in DMSO-d6) δ(ppm)：10.89(1H, s), 7.88(1H, s), 7.69(1H, s), 7.51(1H, d,J=7.8 Hz), 7.35(1H, d,J=8.1 Hz), 7.19(3H, m), 7.08(1H, t,J=7.2 Hz), 7.01(2H, m), 6.76(2H, d,J=6.2 Hz), 4.01(1H, s), 3.89(1H, s), 2.84(1H, m), 2.57(1H, m), 2.52(1H, m), 1.91(1H, m)；

13C-NMR(500 MHz, in DMSO-d6)：166.7(C), 166.1(C), 136.5(8), 136(CH), 129.6(CH), 128.0(CH), 127.5(C), 126.3(CH), 124.3(CH), 120.8(CH), 118.7(CH), 118.4(CH), 111.3(CH), 108.8(C), 55.6(CH), 55.2(CH), 39.8(CH2), 29.6(CH2) 。

化合物L-6為白色粉末。1H-NMR在6-8 ppm 間顯示有5種芳香氫信號存在，表明該化合物有可能含有兩個苯環(huán)結構，在低場區(qū)顯示有一個活潑氫信號；13C-NMR顯示化學位移在166.7(C), 166.1(C)表明有2個羰基存在，化學位移在136.5(8), 136(CH), 129.6(CH), 128.0(CH), 127.5(C), 126.3(CH), 124.3(CH), 120.8(CH), 118.7(CH), 118.4(CH), 111.3(CH), 108.8(C)則分別歸屬于12個芳香碳。

通過與文獻[20]比對，L-6的核磁數據與其報道中的化合物5一致，因此確定化合物L-6為Cyclo-(L-Trp-L-Phe) 。

3.3 抑菌活性的分析

抑菌活性分析見表3。

表3 化合物L-1～L-6的抑菌活性

4 討 論

本實驗以極地土樣為樣本來源，以篩取最具生物活性的菌株為主要目的，通過初步篩選得出菌株SP-1最具生物活性研究潛力。

本實驗鑒定出來的賽氏曲霉，其產生的6個單體化合物中，L-1，L-2，L-3具有抑菌活性，其中，L-1, L-2和L-3對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均有抑菌活性。隨著目前耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢出率越來越高，普遍及各類人群(以新生兒為主)，而目前用于該菌感染的最佳手段仍然是采用抗生素治療方案，大多采用萬古霉素、克林霉素或萬古霉素聯合慶大霉素或利福平等兩種抗生素協同使用，或三種抗生素聯合使用的治療方法。眾所周知，大多數抗生素的耐藥性也是處于不斷增強中。L-1，L-2，L-3具有開發(fā)成新型抗耐藥菌藥物的潛力，從而促進臨床抗耐藥菌藥物的研究進展。

目前，國內外對海洋真菌的研究雖取得很大進展，但研究過程中仍存在不足。在對海洋真菌相關化合物的基因組研究中發(fā)現，菌株的生物合成基因包含許多生物代謝途徑，然而實驗室相對復雜苛刻的海洋環(huán)境來說，所能激活菌株的代謝途徑比較單一，表現在菌株次級代謝產物上就是形成的化合物結構類型比較少，在OSMAC(One Strain-Many Compounds)的策略發(fā)起時，該局限性得到了一定的改善。在針對眾多潛力菌株時，采用該策略，通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件來激活菌株沉默的代謝途徑，從而產生一系列結構新穎、生物活性千差萬別的天然產物。該策略使菌株次級代謝產物的結構類型大大增加，不僅可以產生常規(guī)條件下的化合物，更是可以產生獨特環(huán)境、非常規(guī)條件下的新型化合物，從而更加系統地對潛力菌株進行結構分析和生物活性的研究，從而提高了潛力菌株的篩選價值。

據已有研究顯示，從賽氏曲霉中可以分離出具有細胞毒活性和抗腫瘤活性的單體化合物，堿性蛋白酶廣泛存在于真菌中，主要存在的種屬是賽氏曲霉，即賽氏曲霉還作為堿性蛋白酶產生菌株的潛力菌株正在進行研究。

因此，我們可以將賽氏曲霉作為潛力菌株，從開發(fā)抗腫瘤藥物和堿性蛋白酶方面對其進一步深入研究。同時可以采用OSMAC策略，以提高其篩選價值。