血管性認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型研究進(jìn)展?

李 歐，沙中瑋，吳 雙，李志敏，徐 建

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

血管性認(rèn)知功能障礙(VCI)是指由于一系列血管危險(xiǎn)因素所導(dǎo)致的腦部血管性梗阻進(jìn)而影響人類認(rèn)知功能的一大類綜合征。近年來(lái)，我國(guó)血管性癡呆發(fā)病率逐年上升，然而治療上仍缺乏高效明確的治療藥物。故及早防治血管性癡呆、改善認(rèn)知功能障礙意義重大。因此VCI動(dòng)物模型的有效建立對(duì)研究VCI的發(fā)病機(jī)制、藥物治療有著重要意義。

1 手術(shù)法

1．1 四血管阻斷法(4-VO)

四血管阻斷法最早由Pulsinelli等[1]于1979年提出，將大鼠麻醉后取頸部正中、枕骨后正中切口，電凝針燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈造成永久性閉塞，大鼠蘇醒后使用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈最后縫合。田茂等[2]對(duì)4-VO法進(jìn)行改良，將SD大鼠麻醉后暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，電凝針凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，24 h后行雙側(cè)頸動(dòng)脈夾閉術(shù)，每次夾閉5 min共3次，每次間隔1 h最后縫合。術(shù)后海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷增多，血清中H2S濃度較正常組降低(P<0.05)。4-VO法是國(guó)際公認(rèn)、較經(jīng)典的全腦缺血模型建造方法，但此類手術(shù)方法存在一定難度，手術(shù)步驟復(fù)雜，與實(shí)驗(yàn)操作人員熟練度緊密關(guān)聯(lián)，模型大鼠死亡率高，成活率較低，且風(fēng)險(xiǎn)較大，故此法在實(shí)驗(yàn)中并不常用。

1.2 三血管阻斷法(3-VO)

三血管阻斷法最早由Kameyama M[3]等于1985年提出，手術(shù)大鼠麻醉固定后，在甲狀軟骨上緣鈍性分離肌肉至枕骨的腹面，在骨窗下電凝基底動(dòng)脈，次日行夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈術(shù)。該法可快速制作全腦急性腦缺血模型，但在術(shù)中對(duì)周圍組織神經(jīng)牽拉較嚴(yán)重，尤其是在暴露及電凝基底動(dòng)脈時(shí)易損傷延髓，大鼠死亡率高[4]。周越菡等[5]采用Kameyama M[3]的方法加以改良，結(jié)扎C57BL/6小鼠延髓腹側(cè)面基底動(dòng)脈，24 h后結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)后海馬區(qū)尼氏染色示CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，且CA1區(qū)病理發(fā)現(xiàn)結(jié)扎10 min，大鼠CA1區(qū)細(xì)胞死亡可達(dá)50%。葉偉光等[6]采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈+提線法阻斷基底動(dòng)脈建立模型，暴露大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分離基底動(dòng)脈于股動(dòng)靜脈穿刺置管。待呼吸、心率平穩(wěn)后，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，提線法阻斷基底動(dòng)脈均10 min。術(shù)后大鼠血腦屏障破壞，通透性增加，腦組織核因子、腫瘤壞死因子含量表達(dá)增加。

1.3 兩血管阻斷(2-VO)

兩血管阻斷法是國(guó)內(nèi)較常用的造模方法，造模[7]于頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并永久性結(jié)扎，結(jié)扎時(shí)避免觸碰迷走神經(jīng)。該方法操作簡(jiǎn)便，其原理是通過(guò)緩慢低灌注導(dǎo)致大鼠腦部慢性缺血。模型大鼠術(shù)后出現(xiàn)明顯認(rèn)知功能障礙，但不影響正常肢體活動(dòng)。目前認(rèn)為兩血管阻斷法可行性佳，動(dòng)物存活率較高，適合進(jìn)行慢性腦缺血模型研究，亦是血管性癡呆最常用的動(dòng)物模型[8]。蘇軍紅等[9]采用該法制作VCI動(dòng)物模型，4周后大鼠前腦皮層單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如NE、DA、5-HE含量均較正常組下降(P<0.05)，單胺氧化酶MAO含量升高。

然同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈，易造成大鼠急性腦缺血死亡，死亡率高給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)諸多不變，因此對(duì)2-VO進(jìn)行改良至關(guān)重要。黃新武[10]等采用間隔4 d分別結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈血管，大鼠成活率高，且學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，血流變學(xué)指標(biāo)明顯異常,TNF-α、IL-1β、NO、MDA含量明顯升高,NOS活性顯著增加,SOD活性明顯降低。田先翔等[11]采用Wistar大鼠進(jìn)行夾閉雙側(cè)頸動(dòng)脈5 min后復(fù)灌1 h，連續(xù)重復(fù)3次后永久性結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈血管。大鼠EEG腦電波頻率變慢，振幅逐漸減小甚至呈一直線,復(fù)灌后以上現(xiàn)象逐漸消失且EEG恢復(fù)不完全。毛玲[12]等通過(guò)該法造模后發(fā)現(xiàn)血腦屏障被破壞，海馬區(qū)錐體細(xì)胞和神經(jīng)纖維受損，且該變化與基質(zhì)金屬蛋白酶MPP9含量增加有關(guān)。該方法操作簡(jiǎn)便且大鼠成活率高，造模較成功。

1.4 雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄法(BCAS)

該法模擬臨床頸動(dòng)脈狹窄的患者，通過(guò)短時(shí)間反復(fù)、多次夾閉動(dòng)物雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成動(dòng)物腦部慢行缺血達(dá)到目的。Shibata[13]采用該方法，將兩直徑為0.18 mm的線圈放入小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈處，術(shù)后5～6個(gè)月小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。外徑向臂、巴恩斯迷宮和莫里斯水迷宮表明，BCAS模型復(fù)制了VCI的一些特征，特別是工作記憶的缺陷。羅永堅(jiān)等[14]將大鼠水合氯醛腹腔麻醉后，頸部正中切口分離并暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套4號(hào)絲線扣并拉緊絲扣，同時(shí)將大鼠尾部放血1 ml，阻斷血流20 min后，打開(kāi)絲扣灌注10 min，重復(fù)1次后縫合皮膚，局部切口注射慶大霉素以防感染。術(shù)后1周大鼠腦組織光鏡下可見(jiàn)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞大量凋亡丟失、缺血以及壞死。

1.5 腦血管阻斷法

陳惟昌等[15]采用腦血管直接定位阻斷法建造模型。選取雌性昆明種小鼠42只，小鼠學(xué)習(xí)訓(xùn)練結(jié)束后，將 0.1%海人酸0.3ul溶于生理鹽水中，向每只小鼠單側(cè)右腦室注入1.407 nmol，并逐日測(cè)定其記憶量保持變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，正常組與注射生理鹽水組記憶量變化比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注射海人酸組小鼠記憶保持量逐漸減低，且于術(shù)后第4天完全消失。而鏡下觀察CA3區(qū)海馬神經(jīng)元損傷明顯，對(duì)于CA1區(qū)損傷不明顯。該方法通過(guò)應(yīng)用腦室微量注射海人酸，可選擇性地破壞小鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元及相應(yīng)苔狀纖維突觸連結(jié)區(qū)，該方法造模較成功。但對(duì)于如何精確定位腦室，對(duì)于實(shí)驗(yàn)者技術(shù)操作要求較高。

1.6 栓子法

1.6.1 線栓法 線栓法是栓子造模方法中較常使用的方法之一，較其他方法操作簡(jiǎn)便。Boltze J[16]等在對(duì)綿羊采用線栓法制造血管性癡呆模型中，組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)大腦內(nèi)灰質(zhì)白質(zhì)均有病理性變化，包括膠質(zhì)瘢痕形成、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、新血管形成替代。季兆潔[18]參照L.D.Wang[17]法進(jìn)行改良制作模型，將大鼠麻醉后鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎同側(cè)頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈分叉部，并反向拉直頸外動(dòng)脈，于距離頸總動(dòng)脈末端5 mm處剪口，將直徑0.28 mm魚(yú)線沿頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入，深度約為(18.5±0.5) mm，于頸內(nèi)動(dòng)脈近心端結(jié)扎該動(dòng)脈并縫合切口，2 h后抽出魚(yú)線10 mm以使大腦中動(dòng)脈再灌。大鼠術(shù)后蘇醒可出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體癱瘓、無(wú)力、站立行走不穩(wěn)，提尾時(shí)左側(cè)前爪內(nèi)旋。該方法缺點(diǎn)是模型所應(yīng)用的魚(yú)線入顱后操作是在非直視下進(jìn)行的，血流阻斷與否無(wú)法直觀體現(xiàn)[19]。此外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異如動(dòng)脈血管大小粗細(xì)及放置的魚(yú)線直徑對(duì)模型建造的成功與否均有一定程度的影響。

1.6.2 血栓法 Takagi K[20]等在大鼠右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射直徑700～900 μm的微球，注射15 h后大鼠出現(xiàn)卒中癥狀，并在大腦皮層、海馬、紋狀體部位最為明顯。梅建勛等[21]對(duì)Ishimura[22]法進(jìn)行改良，采用同種品系大鼠左心室采血、研磨、篩孔過(guò)篩后，取血栓栓子(1 mg)與生理鹽水(0.3 ml)混勻制成混懸液，大鼠腹腔麻醉后暴露頸內(nèi)、頸外、頸總動(dòng)脈。暫時(shí)夾閉大鼠頸總動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈逆行注入一定量的血栓栓子溶液，并同時(shí)開(kāi)放頸總動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈并縫合傷口。造模后大鼠在下丘腦、海馬部位均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)元腫脹、變性及壞死。該法模擬人類多發(fā)性梗死癡呆的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)將血栓注入大鼠腦部血管內(nèi)，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈使其腦部各動(dòng)脈出現(xiàn)多發(fā)性缺血性梗塞。此法類似臨床腦中風(fēng)發(fā)病機(jī)制，較舌下注入鐵粉法造成單一部位腦梗塞有一定程度的改善。然栓子的體積、大小、速度不同，易造成血栓在腦部動(dòng)脈梗塞的位置、梗塞面積的不同，造模結(jié)果個(gè)體差異較大，模型不確定性因素較多。

1.7 注射鐵粉

林堅(jiān)等[23]將大鼠正中切開(kāi)頭皮暴露顱骨，在額前囟部前2 mm、左旁開(kāi)2 mm安置電極，參考電極位于遠(yuǎn)額竇，小螺絲固定上述部位，同時(shí)在額部記錄電極處正后方固定一小磁鐵。水迷宮測(cè)試后，將四氧化三鐵粉末(56.4 mg/kg)溶于1.5 ml生理鹽水中，于1 min內(nèi)注入大鼠舌下靜脈，分別于術(shù)后2 h、4 h、1 d、2 d、3 d觀察大鼠行走、痛覺(jué)反應(yīng)能力均有減弱，腦組織肉眼及鏡下均可見(jiàn)明顯的血管性栓塞。該方法操作難度低，動(dòng)物創(chuàng)面損傷小，可重復(fù)性強(qiáng)，死亡率較血管阻斷法低，且模型成功率高。但該法造成血管性阻塞部位較為局限且單一，對(duì)于多部位缺血梗阻的動(dòng)物模型無(wú)法進(jìn)行有效模擬。

2 非手術(shù)操作

2.1 高半胱氨酸血癥模型

半胱氨酸是公認(rèn)的導(dǎo)致心腦血管疾病的高危因素。Sudduth等[24]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)基因或飲食改變可導(dǎo)致半胱氨酸水平增高，可誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)認(rèn)知障礙。將APP/PS1小鼠放置于缺乏維生素B6、B12、葉酸，富含蛋氨酸的環(huán)境中，建造高半胱氨酸小鼠模型。行為學(xué)水迷宮檢測(cè)中，模型小鼠出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶能力障礙，此外小鼠品種、飼養(yǎng)方式對(duì)該模型的建造也有一定程度的影響。

2.2 2型糖尿病大鼠模型

Niedowicz 等[25]將癡呆小鼠與APPDNL/DNL 9 PS1P264 L/P264 L基因敲除的糖尿病小鼠雜交。該種小鼠模型沒(méi)有出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白變性，但在Morries水迷宮測(cè)試中出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶能力障礙及病理學(xué)改變，包括海馬膽堿能軸突受體、標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、血管炎癥等。糖尿病與癡呆均可導(dǎo)致血管樣病變。該方法操作步驟簡(jiǎn)便，造模后大鼠未出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙。通過(guò)模擬糖尿病發(fā)病機(jī)制，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)血管樣病變，但與臨床VCI多因素發(fā)病不盡相同。

2.3 自發(fā)性腦卒中大鼠模型(SHR/SP)

由Yamori[26]在日本開(kāi)發(fā)的WKY遺傳變異大鼠模型。此種模型大鼠在出生3個(gè)月后收縮壓達(dá)到200mmHg，平均約9個(gè)月即出現(xiàn)腦梗塞或腦出血，5個(gè)月即發(fā)現(xiàn)腦部血流量在額區(qū)減少。Yamori等發(fā)現(xiàn)，SHR/SP較WKY模型血管易脆性大，通過(guò)改變SHR/SP模型大鼠的喂養(yǎng)方式或?qū)δＰ瓦M(jìn)行單側(cè)血管結(jié)扎，可加速或減慢其形成血管性認(rèn)知功能障礙的周期時(shí)間。但該種模型存活時(shí)間較短，一般多為9～12個(gè)月，且與臨床VCI患者發(fā)病因素多元化不盡相同。同時(shí)該模型價(jià)格昂貴，其廣泛應(yīng)用于科研亟待進(jìn)一步研究。

3 復(fù)合法

高血脂喂養(yǎng)復(fù)合法:邵瑛等[27]先采用兩腎一夾高血壓模型法制造高血壓大鼠模型，術(shù)后1周喂養(yǎng)高脂飼料，再此基礎(chǔ)上采用改良2-VO法制作高血壓高血脂VCI大鼠模型。術(shù)后電鏡下海馬突觸數(shù)目、囊泡數(shù)量少,在突觸前膜處稀疏聚集。該法通過(guò)先造成大鼠心血管及微循環(huán)系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致大鼠高血壓、高血脂繼而發(fā)生大腦低灌注而致腦缺血模型。此模型建造與人類高血壓病腦梗塞發(fā)病機(jī)制最為接近。

4 其他

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物較嚙齒類動(dòng)物更易建造血管性認(rèn)知功能障礙模型。已有報(bào)道，在家養(yǎng)犬具有缺乏運(yùn)動(dòng)、血脂高等特點(diǎn)，犬類認(rèn)知功能障礙的表現(xiàn)與臨床VCI發(fā)病特征具有相似性[28]。Boltze J等[29]對(duì)羊進(jìn)行MCAo手術(shù)，術(shù)后組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)腦白質(zhì)發(fā)生病變，包括膠質(zhì)瘢痕形成，小膠質(zhì)細(xì)胞活化和新血管、泡沫狀脂肪細(xì)胞的形成替代。Schutt[30]等發(fā)現(xiàn)，老年犬在晚期認(rèn)知功能下降、大腦皮層萎縮、心室擴(kuò)大的表現(xiàn)與人類VCI發(fā)病機(jī)理相似。

5 結(jié)語(yǔ)

目前血管性認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。近年來(lái)，對(duì)于血管性認(rèn)知功能障礙模型建造方法也在不斷探索。實(shí)驗(yàn)中常用兩血管阻斷法、栓子法，多采用Morries水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力以評(píng)價(jià)其認(rèn)知功能有無(wú)出現(xiàn)障礙。該模型建造主要存在模型動(dòng)物死亡率高、操作技術(shù)水平要求高、大鼠個(gè)體差異影響較大且與臨床VCI發(fā)病機(jī)制仍有一定差異等多種問(wèn)題。

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