內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展*

張靜靜， 王 崗△， 李滿祥

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科， 陜西 西安 710004； 2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 陜西 西安 710061)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是由多種已知和未知原因引起的肺循環(huán)血壓異常升高的一種病理生理綜合癥，主要累及心血管及呼吸系統(tǒng)[1-2]。根據(jù)2015年最新PH的臨床分型，PH分為動(dòng)脈型肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)、左心疾病所致PH、肺部疾病或缺氧所致PH、慢性血栓栓塞性PH(chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH)和其它不明原因或多種機(jī)制導(dǎo)致的PH[3]。其中，PAH又分不同亞型，包括特發(fā)性PAH(idiopathic PAH，IPAH)、遺傳性PAH(he-ritable PAH，HPAH)、藥物和毒物誘導(dǎo)的PAH及疾病(結(jié)締組織病、HIV感染、血吸蟲病等)相關(guān)性PAH[4]。PAH診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是在靜息狀態(tài)下，右心導(dǎo)管測量平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)≥25 mmHg，肺毛細(xì)血管楔壓(pulmonary artery wedge pressure，PAWP)≤15 mmHg且肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)>3 mmHg的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，同時(shí)排除其它臨床類型的PH[3]。

盡管不同類型PAH的病因不同，但有很多相似的病理特點(diǎn)，包括進(jìn)行性外膜和中膜增厚、偏心或向心性內(nèi)膜增厚、動(dòng)脈血管閉塞和再通以及叢狀病損[5]。內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)功能障礙和平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)增殖導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，使肺血管阻力及肺動(dòng)脈壓力逐漸增加，最終導(dǎo)致進(jìn)行性右心室功能障礙和患者死亡[5]。眾所周知，PAH診斷困難，有效的治療藥物較少。1998年后，針對EC功能紊亂的3大經(jīng)典途徑，即前列環(huán)素通路、內(nèi)皮素1受體通路和一氧化氮通路的靶向藥物陸續(xù)進(jìn)入臨床，這些藥物雖不能根治PAH，但可使PAH患者的1年、3年和5年生存率分別升高12%、27%和30%[6]。

經(jīng)過近幾年的實(shí)驗(yàn)研究，人們發(fā)現(xiàn)PAH跟腫瘤的發(fā)病機(jī)制有許多相似之處，如內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)在一定程度上也能夠?qū)е路窝苤厮?，促進(jìn)PAH的形成?；熕幾仙即纪ㄟ^對轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)/骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogentic protein,BMP)信號通路中FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的激活作用，最終對EndMT產(chǎn)生抑制作用，現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于PAH的治療[7]。針對肺動(dòng)脈EndMT調(diào)控通路的研究對PAH的治療應(yīng)該具有一定的指導(dǎo)意義，通過對TGF-β/BMP信號通路的靶向干預(yù)也許將成為未來治療PAH的突破點(diǎn)之一。基于此，本篇主要針對EndMT及其相關(guān)信號通路在PAH血管重構(gòu)中調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，為PAH以后的治療模式提供新的理論依據(jù)。

1 EndMT概述

在胚胎發(fā)育階段和后天受到外界病理性刺激時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞從血管腔表面逐漸分離，并遷移到內(nèi)皮下組織。這種遷移與血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin/CD144)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)和骨架蛋白(p120-catenin)等膜蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞間黏附能力喪失有關(guān)。由此內(nèi)皮細(xì)胞獲得了遷移和浸潤能力，促使它們到達(dá)周圍組織。而在遷移過程中，內(nèi)皮細(xì)胞丟失了其自身標(biāo)志物CD31和CD144，而逐漸表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vimentin)，即EndMT[8]。

EndMT屬于上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的特殊形式。EMT發(fā)生于上皮細(xì)胞中，在胚胎發(fā)育過程及上皮損害、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理變化中也發(fā)揮著重要作用[8]。EndMT和EMT的過程都能使細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型，而且有部分共同的信號傳導(dǎo)通路。多家研究機(jī)構(gòu)也在胚胎發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞有轉(zhuǎn)化為血管平滑肌細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞的能力[9]。Arciniegas等[9]通過免疫組化的方法觀察雞胚不同發(fā)育階段的血管，發(fā)現(xiàn)EndMT過程促進(jìn)主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈的發(fā)育成熟;利用膠體金標(biāo)記技術(shù)，DeRuiter等[10]的研究結(jié)果顯示在鵪鶉胚胎血管發(fā)育的早期階段，被標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞可能出現(xiàn)在血管內(nèi)皮下組織并且表達(dá)α-SMA;對人體胚胎血管進(jìn)行免疫組化和三維重建也證實(shí)了以上觀點(diǎn)[11]。此外，EndMT也參與多種疾病的病理過程，如心、腎等器官的病理性纖維化[12-14]和致瘤性轉(zhuǎn)化[15]等。目前，EndMT作為一種重要的生理調(diào)控和病理改變機(jī)制已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。

2 EndMT參與PAH的形成

內(nèi)皮細(xì)胞屏障的完整性破壞和不斷增強(qiáng)的炎癥細(xì)胞浸潤是PAH肺血管重塑的共同病理學(xué)特點(diǎn)[16-17]。事實(shí)上這些病理變化或多或少以表達(dá)α-SMA陽性細(xì)胞為特點(diǎn)[18]?？墒沁@些細(xì)胞的來源和造成其在病損部位沉積的分子機(jī)制目前并沒有闡明。過去認(rèn)為α-SMA陽性細(xì)胞來源于常駐血管中膜SMC的去分化以及外膜纖維母細(xì)胞的分化，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行增殖與擴(kuò)張。隨著病理生理學(xué)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)肺血管EC能轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞并表達(dá)α-SMA，這個(gè)過程促進(jìn)平滑肌樣細(xì)胞在血管病損部位的累積，造成肺血管重塑，引起PAH[19]。

2002年，F(xiàn)rid等[20]將小牛成熟肺血管EC體外培養(yǎng)，并暴露于慢性壓力和炎癥因子中6 d左右，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞或者平滑肌樣細(xì)胞表型，即VE-cadherin表達(dá)明顯減少，而α-SMA表達(dá)增加，發(fā)生了EndMT。2006年，人們在低氧誘導(dǎo)的PAH大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，受心肌素(myocardin)的調(diào)控，肺血管EC能轉(zhuǎn)分化為平滑肌樣細(xì)胞，并導(dǎo)致肺血管阻力的增加，而用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制心肌素的表達(dá)，能抑制此過程的發(fā)生[21]。

2015年，在人PAH肺組織動(dòng)脈內(nèi)膜和叢狀病損部位，Ranchoux等[5]發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary arterial endothelial cells，PAECs)中同時(shí)存在間充質(zhì)/內(nèi)皮表型(α-SMA和CD34)及EndMT相關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子Twist-1的高表達(dá)，這為 EndMT過程參與人體PAH的形成提供了有力證據(jù)。同年，Good等[22]通過實(shí)驗(yàn)證明炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)聯(lián)合TGF-β能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人PAECs進(jìn)行EndMT過程。在這個(gè)過程中，PAECs失去了內(nèi)皮細(xì)胞的鵝卵石樣結(jié)構(gòu)特征并進(jìn)行細(xì)胞骨架重排，形成跟纖維母細(xì)胞形態(tài)相似的紡錘體樣細(xì)胞。這些EndMT細(xì)胞(即過渡細(xì)胞)呈現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)(I型膠原蛋白和α-SMA)，以及內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白的下降(CD31和VE-cadherin)。而且這些過渡細(xì)胞本身也分泌高水平的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α，都將加速肺血管重塑的進(jìn)程和PAH的形成?？傊谓M織在受到低氧、炎癥或者野百合堿等毒物刺激時(shí)，肺血管內(nèi)膜發(fā)生損害，機(jī)體通過一系列調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行組織血管的修復(fù)，就可能出現(xiàn)部分PAECs進(jìn)行間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，最終造成PAH的形成。因此研究EndMT過程的發(fā)生機(jī)制、調(diào)節(jié)分子和傳導(dǎo)通路，對抑制血管重塑及研發(fā)肺血管高壓新療法都至關(guān)重要。

3 TGF-β/BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

隨著PAH中EndMT過程研究的不斷深入，越來越多的調(diào)控分子以及傳導(dǎo)通路被發(fā)現(xiàn)并研究，TGF-β/BMP通路無疑作為最重要的一條備受關(guān)注。其中，TGF-β超家族成員是EndMT過程最常見的誘導(dǎo)因素，其成員主要包括TGF-β、BMP、活化素(activin)和生長分化因子(growth differentiation factor，GDF)等。BMP受體2(BMP receptor 2，BMPR2)是TGF-β超家族受體的一個(gè)成員，同時(shí)是HPAH最常見的一種基因突變，占到HPAH的70%以上，占到IPAH的10%～40%水平[23]。PAECs可在TGF-β信號的誘導(dǎo)下發(fā)生EndMT，但與此同時(shí)，EndMT也可以被BMPR2抑制[24-25]。因此本文將主要圍繞TGF-β/BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控分子進(jìn)行闡述。

3.1BMPR2基因 研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠PAH模型中，過表達(dá)BMPR2基因能減緩肺血管重塑，較少出現(xiàn)右室肥厚和肺血管阻力增加[26]。此外，TGF-β1能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人PAECs發(fā)生EndMT，并引起B(yǎng)MPR2基因表達(dá)降低[26]。在野百合堿誘導(dǎo)的PAH動(dòng)物模型中，TGF-β信號明顯增強(qiáng)，但通過腺病毒過表達(dá)BMPR2也能一定程度上減輕肺血管阻力，比如實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定的BMPR2活化劑FK506(他克莫司)能有效緩解PAH的癥狀[27]。正常情況下，BMPR2與活化素受體樣激酶(activin receptor-like kinase，ALK)可以形成異二聚體[28]，不同種類的ALK與BMPR2的結(jié)合導(dǎo)致不同的配體親和力，從而在組織中對BMP表現(xiàn)不同的敏感性和結(jié)合力。值得注意的是，在人肺組織微血管EC中，BMPR2/ALK-1異二聚體信號對BMP9/10具有相對特異性[29]，而在肺的平滑肌細(xì)胞中，BMPR2與ALK-3或ALK-6結(jié)合形成的異二聚體信號對BMP2/4具有相對特異性[30]。在與配體結(jié)合以后，這3個(gè)物質(zhì)形成的復(fù)合物BMPR2/ALK/BMP會(huì)導(dǎo)致SMAD蛋白磷酸化，引起核移位，最后通過SMAD結(jié)合元件在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程[31]。

當(dāng)BMPR2基因突變或者特定外顯子堿基對被刪除，會(huì)出現(xiàn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的肌型轉(zhuǎn)化，免疫組化顯示Twist-1和磷酸化vimentin過表達(dá)，這為EndMT過程的形成提供了證據(jù)[5]。有研究表明，即使在無BMPR2基因突變的前提下，PAH患者中BMPR2基因的表達(dá)也會(huì)降低[32]，說明可能有其它的調(diào)控因素同時(shí)影響這條傳導(dǎo)通路；而且在HPAH中，雖然這種疾病屬于常染色體顯性遺傳，但只有20%的攜帶者發(fā)展為疾病[33]，也說明還有其它的宿主或者環(huán)境因素起作用。芳香化酶抑制劑阿那曲唑(anastrozole)、溶酶體酶抑制劑氯喹、紫杉醇(paclitaxel)等或多或少會(huì)影響B(tài)MPR2/ALK信號通路[7]，但具體的作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步的研究。

3.2高遷移率族蛋白A1(high mobility group protein A1，HMGA1) 高通量RNA測序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPAH患者PAECs中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)因子HMGA1較對照組表達(dá)增加[34]。HMGA1結(jié)合DNA的富AT區(qū)域，改變核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄活性，是重要的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)因子家族成員[35]。通常HMGA1分子高表達(dá)在胚胎發(fā)育的干細(xì)胞中，但在已經(jīng)分化的組織中表達(dá)很低或不表達(dá)[36]。在多種腫瘤發(fā)生過程中，HMGA1分子的異常升高通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)其致瘤性轉(zhuǎn)化[15]。這種轉(zhuǎn)變歸因于對上皮細(xì)胞連接蛋白E-cadherin的抑制和間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的上調(diào)。

Hopper等[35]假設(shè)HMGA1增加也可誘導(dǎo)PAECs轉(zhuǎn)化為平滑肌樣間充質(zhì)表型，即EndMT，進(jìn)行肺血管重塑，導(dǎo)致PAH。他們利用共聚焦顯微鏡觀察到人肺組織局部HMGA1增加促進(jìn)PAECs的持續(xù)轉(zhuǎn)化，同時(shí)確定在閉塞性和致叢性病變部位，許多內(nèi)膜細(xì)胞表現(xiàn)為內(nèi)皮表型標(biāo)志物von Willebrand因子(von Willebrand factor, vWF)和間充質(zhì)表型標(biāo)志物平滑肌22α(SM22α)雙陽性。通過siRNA減少正常人群中的BMPR2表達(dá)，觀察到HMGA1蛋白的表達(dá)也相應(yīng)增加。這與HMGA1促進(jìn)PAECs轉(zhuǎn)化相一致，都表現(xiàn)為PECAM-1/CD31減少，而間充質(zhì)表型標(biāo)志物增加，即α-SMA、SM22α、 磷酸化vimentin、Slug和Snail蛋白增加。Snail和Slug是與EndMT或EMT密切相關(guān)的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子[37]，Slug和Snail會(huì)阻遏VE-cadherin蛋白的基因表達(dá)[38]，導(dǎo)致細(xì)胞橋粒離解，對于生長因子誘發(fā)的EndMT是一個(gè)始動(dòng)和必要的因素[39]。而HMGA2作為和HMGA1緊密相關(guān)的蛋白，通過結(jié)合啟動(dòng)子和募集SMAD蛋白提高SNAIL基因的轉(zhuǎn)錄，直接影響Snail蛋白的表達(dá)[40]，即BMPR2基因突變，上調(diào)HMGA1基因，導(dǎo)致Slug和Snail蛋白的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)EndMT過程[35]。

3.3其它調(diào)控分子 在細(xì)胞膜上，BMPR2能與小窩蛋白1(caveolin-1，CAV1)直接相互作用而抑制血管增殖[41]。其它研究顯示在PAH中BMPR2還可以通過磷酸化血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRC)調(diào)控CAV1蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，進(jìn)而抑制血管增殖[42]。伊馬替尼(imatinib)作為血小板源性生長因子受體拮抗劑，也能一定程度上緩解EndMT的進(jìn)程，但其機(jī)制尚不明確[43]。此外，細(xì)胞的遷移有賴于各種蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMP)和絲氨酸蛋白酶家族就能加速EndMT的過程。雷帕霉素或者雷帕霉素類似物在野百合堿導(dǎo)致的PAH模型中能部分抑制EndMT的機(jī)制，可能在于雷帕霉素通過誘導(dǎo)VE-cadherin的表達(dá)，阻止EC的遷移，阻止 vimentin和Twist-1蛋白的表達(dá)，抑制EC MMP-2和MMP-9[44]。

總之，除了TGF-β/BMP這條主要的信號通路外，EndMT還可能涉及其它多種信號通路，而且信號通路之間往往具有交互作用。研究肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制，尤其是EndMT的發(fā)生機(jī)制，對尋找治療新靶點(diǎn)，抑制肺血管重塑都有重要意義。