哺乳動物雙極細(xì)胞生理構(gòu)造及功能比較研究進(jìn)展

張 馳，胡 敏*，孫曉梅，周 圓

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科，云南省眼科研究所/云南省眼科疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650021； 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118)

視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞是哺乳動物視覺系統(tǒng)的第一個“投射神經(jīng)元”，它收集由感光細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成的電信號，通過不同類型雙極細(xì)胞(bipolar cells)的收集和整合，繼續(xù)傳遞至無長突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)，以便在視網(wǎng)膜內(nèi)進(jìn)一步處理。這一過程中，無論昆蟲或是人類，所有視覺形成所需的信息都是通過這種視網(wǎng)膜內(nèi)連接方式來傳遞。在當(dāng)前研究下，生物物理學(xué)、藥理學(xué)、膜電容測定、熒光生物傳感器和雙光子顯微鏡等技術(shù)的不斷完善，特別是相關(guān)的免疫組化技術(shù)發(fā)展更為迅速，通過這些方法逐漸發(fā)現(xiàn)至少有10余種不同類型的雙極細(xì)胞以不同方式系統(tǒng)地轉(zhuǎn)換光感受器輸入信號，從而激發(fā)編碼感光刺激特性的特定通道[1]。由于雙極細(xì)胞對視覺研究的重要性日益增加，及其在感覺神經(jīng)元中的代表性意義，對視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞的研究成為熱點(diǎn)。本文綜述近十年運(yùn)用免疫組化等方法利用大、小鼠及非人靈長類等實(shí)驗(yàn)動物而展開的雙極細(xì)胞生理構(gòu)造及功能的比較研究進(jìn)展，目的是通過動物實(shí)驗(yàn)獲得視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞形態(tài)、功能和突觸可塑性等相關(guān)數(shù)據(jù)，更好的為人類臨床眼底疾病治療探尋新的思路和方法。

1 雙極細(xì)胞的歷史發(fā)展

視覺系統(tǒng)的一個突出特征是在視網(wǎng)膜中存在異常大量的神經(jīng)元“硬件”，與其他主要的感覺系統(tǒng)相比，視覺系統(tǒng)中存在一層特殊的神經(jīng)元，隨機(jī)分布于其所在的空間之中[2]，將初級感覺神經(jīng)元與長投射神經(jīng)元連接起來，即視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞層。Tartuferi[3]被認(rèn)為最早發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)造了“雙極細(xì)胞”這個術(shù)語，即：哺乳動物中具有兩個突起的視網(wǎng)膜中間神經(jīng)元，因其“一個向上”和“一個向下”的細(xì)胞形態(tài)而創(chuàng)造出“雙極細(xì)胞”一詞。這種獨(dú)特的形態(tài)是其功能的一個標(biāo)志，因?yàn)殡p極細(xì)胞的主要功能即連接外層和內(nèi)層視網(wǎng)膜。人們也一直通過實(shí)驗(yàn)動物與人類視網(wǎng)膜相似的地方來研究雙極細(xì)胞在視網(wǎng)膜中信號整合等方面的作用[4]，從而進(jìn)一步提高眼科疾病患者復(fù)明的希望。

2 雙極細(xì)胞的多樣性

在哺乳動物視網(wǎng)膜中存在十多種雙極細(xì)胞類型，根據(jù)對光反應(yīng)極性的不同，包括：給光型視錐雙極細(xì)胞(ON-cone bipolar cell，ON-CBC)和撤光型視錐雙極細(xì)胞(OFF-cone bipolar cell，OFF-CBC)，前者略多于后者，同時，還包含一種給光型的視桿雙極細(xì)胞(rod bipolar cell，RBC)[5-6]，然而，這在非哺乳類動物中可能有很大差異。例如：在斑馬魚中大概含有20多種類型的雙極細(xì)胞，其中包括幾種雙層甚至三層的類型，這可能由于它們的光感受器多樣性較高所致[7]?，F(xiàn)已證實(shí)小鼠體內(nèi)一共存在有15種類型的雙極細(xì)胞[8]，包括：一種RBC；1 ～ 9型CBC，其中3型分為3a和3b兩種，5型分為5i、5o和5t三種；一種新型X雙極細(xì)胞和近期新發(fā)現(xiàn)的一種沒有樹突的特殊類型的雙極細(xì)胞[9-12]。在其他被研究的哺乳動物中，如：貓、兔、大鼠、小鼠、地松鼠、獼猴等，其雙極細(xì)胞的類型數(shù)目也穩(wěn)定在大約10余種左右[13]。

3 雙極細(xì)胞類型的鑒定及比較

哺乳動物視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞類型的解剖或組織學(xué)鑒定，對于應(yīng)用其遺傳學(xué)分析視網(wǎng)膜回路和分析引起視網(wǎng)膜疾病的基因具有重要意義。通常比較不同哺乳動物雙極細(xì)胞分類的主要標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)特征，樹突狀分支模式以及在內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)突觸終端的形狀和分層程度。其中，軸突形狀和其在IPL分層水平通常是雙極細(xì)胞類型識別的最佳依據(jù)；此外，樹突形態(tài)的差異，如接觸的光感受器的數(shù)量和類型，也有助于區(qū)分雙極細(xì)胞類型。然而，不同物種的視網(wǎng)膜在各自生活環(huán)境中發(fā)生了不同的適應(yīng)，如樹鼩等晝行性動物具有更多的視錐細(xì)胞[14]，貓等夜行性動物多含有豐富的視桿細(xì)胞[15]。許多哺乳動物表現(xiàn)出獨(dú)有的視網(wǎng)膜特征，如非人靈長類動物的視網(wǎng)膜中心凹[16]，在兔眼中存在的視覺條紋和不同視錐蛋白的分泌[17]，小鼠不同的RGCs在視網(wǎng)膜的分布[18-19]。此外，由于歷史原因，雙極細(xì)胞類型命名在不同物種之間仍然不一致。這些都導(dǎo)致很難僅僅根據(jù)細(xì)胞形態(tài)來進(jìn)行物種間的比較。

一般認(rèn)為哺乳動物IPL被細(xì)分為五層，厚度幾乎相等。在小鼠中，這些層可以通過免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記鈣視網(wǎng)膜蛋白(calretinin)來確定，它是揭示這些特征的重要工具。然而，在同種雙極細(xì)胞中，細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)似乎在不同物種之間有很大差異。許多標(biāo)記似乎又可以在不同的物種中標(biāo)記同源雙極細(xì)胞類型。研究發(fā)現(xiàn)，針對蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)的抗體最早發(fā)現(xiàn)可標(biāo)記魚視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞[20]。后來逐漸發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用在鼠、兔、樹鼩、獼猴等大部分哺乳動物視桿雙極細(xì)胞的標(biāo)記[1, 21]。鈣結(jié)合蛋白calbindin在非人靈長類視網(wǎng)膜上可標(biāo)記所有視錐細(xì)胞、一種OFF-CBC和一種水平細(xì)胞[22]；在兔視網(wǎng)膜中，calbindin強(qiáng)表達(dá)于一種ON-CBC和一種水平細(xì)胞；而在大鼠和小鼠視網(wǎng)膜中，calbindin則可見于水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞和RGCs，在雙極細(xì)胞中則看不到[23]。除了上述標(biāo)記物外，如：鉀/鈉超極化激活環(huán)核苷酸門控通道4(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 4，HCN4)的表達(dá)，標(biāo)記了跨物種間明顯的非同源細(xì)胞類型。在某些情況下，可以通過選擇免疫組化的方式來區(qū)分單群種的雙極細(xì)胞，例如，小鼠的3a和3b型雙極細(xì)胞[24]，它們在形態(tài)上非常相似，可采用表達(dá)HCN4和蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基IIβ(PKA的一個調(diào)節(jié)亞單位，protein kinase regulatory subunit II beta，PKARIIβ)的方式，通過觀察其樹突與軸突在視網(wǎng)膜的形態(tài)，來區(qū)分兩種類型的細(xì)胞[6]。這是許多視網(wǎng)膜神經(jīng)元類型區(qū)分的基本規(guī)則。

過去的研究中，在這方面已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但到目前為止，還沒有清晰描述出所有雙極細(xì)胞的免疫組化表達(dá)標(biāo)記，小鼠和地松鼠是為數(shù)不多的研究較為完善的兩類實(shí)驗(yàn)物種。

在以視桿細(xì)胞為主的小鼠視網(wǎng)膜中：所有的ON-CBC可以表達(dá)G蛋白亞基Gαo和Gγ13[25-26]，RBC可以特異性表達(dá)PKCα及鈣結(jié)合蛋白5(calcium binding protein 5，CaB5)[27]，同時CaB5還可以表達(dá)在3a/b、5、6型雙極細(xì)胞；從神經(jīng)激肽3型受體(neurokinin 3 receptor，NK3R)的表達(dá)可以鑒別出1型和2型OFF-CBC，但是它們之間更為細(xì)致的差別無法區(qū)分[27-28]；HCN4可顯示3a型雙極細(xì)胞，PKARIIβ可顯示3b型雙極細(xì)胞[29]，恢復(fù)素(recoverin)可表達(dá)于2型雙極細(xì)胞[30]，calsenilin蛋白可表達(dá)于4型雙極細(xì)胞[31]，促泌素(secretagogin，SCGN)表達(dá)較為廣泛，可顯示于2、3a/b、4、5、6型帶有明顯樹突標(biāo)志的雙極細(xì)胞[32]。

在以視錐細(xì)胞為主的地松鼠視網(wǎng)膜中：通過免疫組化區(qū)分了8種不同的視錐雙極細(xì)胞類型(3種ON型和5種OFF型)和一種RBC。與小鼠相類似，Gγ13可標(biāo)記ON型雙極細(xì)胞，recoverin、HCN4可標(biāo)記OFF型雙極細(xì)胞，CaB5可表達(dá)兩種ON-CBC及兩種OFF-CBC，細(xì)胞粘附分子分化抗原15(cluster of differentiation 15，CD15)廣泛分布于ON-CBC。與大多數(shù)哺乳類不同，PKCα并非只標(biāo)記RBC，其在幾種不同的雙極細(xì)胞類型均有出現(xiàn)[26, 33]。其他可靠的雙極細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記物依然有待探索。

4 雙極細(xì)胞與其上下級神經(jīng)元之間突觸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

視網(wǎng)膜是由三個細(xì)胞核層以及兩個叢狀(突觸)層構(gòu)成[34]。光線進(jìn)入眼睛后，通過整個組織首先到達(dá)視網(wǎng)膜的外部光覺感受器——視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞。視錐細(xì)胞軸突末端膨大，在多個雙極細(xì)胞的樹突形成突觸。然而視桿細(xì)胞的終足形成球狀，只與單個雙極細(xì)胞的樹突形成突觸，單個雙極細(xì)胞突觸終端的光信號活動可以在鈣離子[35-36]或谷氨酸[37-38]信號水平上隨著其在突觸的釋放被常規(guī)記錄下來，從而繼續(xù)向下一級神經(jīng)元傳遞。在外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)上形成第一突觸層，該層信號分布在10余種雙極細(xì)胞上，形成平行的信息通路，為內(nèi)層視網(wǎng)膜提供高度預(yù)處理的興奮性信號[9, 39-40]。在IPL、OFF-CBC的樹突前膜沒有緞帶突觸，其突觸后膜表達(dá)離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors，iGluRs)。而ON-CBC和RBC樹突會與視網(wǎng)膜水平細(xì)胞的樹突陷入突觸前膜形成陷入型突觸，并與光感受器形成的緞帶突觸[41]，其通過代謝型谷氨酸受體6亞型(metabotropic glutamate receptors 6，mGluR6)、多巴胺受體等的活動可受水平細(xì)胞調(diào)控[42]。在這里，光感受器還可以和水平細(xì)胞的神經(jīng)元相連接，當(dāng)水平細(xì)胞接受光感受器的突觸傳遞后與光感受器和雙極細(xì)胞的突觸終末端形成突觸聯(lián)系，然后通過三者間縫隙連接將沖動傳遞給RGCs，這種反饋性突觸的形式在視網(wǎng)膜信息傳遞中也是極為重要的[43-44]。

隨后，雙極細(xì)胞軸突末端與無長突細(xì)胞和RGCs的突觸連接[45]。無長突細(xì)胞是視網(wǎng)膜細(xì)胞中最為多元的細(xì)胞類型(存在42種左右的類別)，主要向雙極細(xì)胞和RGCs提供神經(jīng)調(diào)節(jié)性的信號[1, 46]。20余種RGCs整合來自雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞的信號，并將結(jié)果編碼為一系列的信號源，通過軸突被傳送到更為高級的視覺中心，最終將視網(wǎng)膜的信號提供給大腦，從而完成整個光信號在視神經(jīng)系統(tǒng)中傳遞的任務(wù)[6, 47-48]。來自小鼠視網(wǎng)膜的聯(lián)接組學(xué)數(shù)據(jù)[9]和轉(zhuǎn)基因動物的大量數(shù)據(jù)表明雙極細(xì)胞可以表達(dá)特定的受體蛋白，同時不同物種的免疫標(biāo)記[49-51]反映出雙極細(xì)胞軸突末端與無長突細(xì)胞和RGCs樹突的共分層，這是突觸連接性的有力標(biāo)志。

5 雙極細(xì)胞的生理與電生理調(diào)控

研究表明，哺乳動物的RBCs以外向型鉀離子電流為主要特征，其在視功能活動中占有主要的地位。在針對小鼠、非人靈長類動物和人類的視網(wǎng)膜RBCs進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗電生理技術(shù)記錄時發(fā)現(xiàn)：當(dāng)給予去極化及超極化脈沖刺激時，均表現(xiàn)出去極化脈沖時的外向鉀離子電流[52-53]，然而在不同亞型的RBCs之間這種外向型電流是有差異的。其中有不到5% RBCs會發(fā)出微弱的內(nèi)向鈉離子電流，Ohkuma等人[53]認(rèn)為這種鈉離子電流在雙極細(xì)胞層面的視覺電生理活動中作用甚微。Walston等人[54]發(fā)現(xiàn)，ON型雙極細(xì)胞對電刺激具有去極化電壓瞬變的反應(yīng)，這與電刺激的幅度、脈沖寬度和頻率有關(guān)，而對于OFF型雙極細(xì)胞通路尚未有更多的探索。對OFF型雙極細(xì)胞通路的特性的研究對于研究人員了解視網(wǎng)膜具有重要意義，需要進(jìn)一步探究。

視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)是眼科臨床視覺電生理重要的輔助檢查之一，可進(jìn)行視覺功能預(yù)測，眼部疾病受累部位判定等。一般認(rèn)為在ERG中：a波主要來源于感光細(xì)胞的感受器電位；b波幅度較大，主要與雙極細(xì)胞的活動有關(guān)；c波上升緩慢而持久，可能與色素上皮細(xì)胞層的正常功能有關(guān)；d波為一種撤光反應(yīng)。而在哺乳動物的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：豚鼠較獼猴ERG各指標(biāo)數(shù)據(jù)明顯降低；大鼠與獼猴相比，其數(shù)值也相對偏離；從總體數(shù)值上可以發(fā)現(xiàn)，獼猴視網(wǎng)膜電圖各指標(biāo)較其他動物更接近于人類[55]。

6 雙極細(xì)胞突觸可塑性

正常情況下，成年哺乳動物視網(wǎng)膜是一個穩(wěn)定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，但當(dāng)其因損傷或疾病而造成光感受器的丟失時，它可表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和突觸的可塑性。由此表明內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)元的傳入影響著視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致視覺回路連接和功能的異常[34]。Dunn等[56]通過對三種類型的雙極細(xì)胞突觸及其共同的光感受器靶點(diǎn)的成像研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)育中不同類型的小鼠視錐雙極細(xì)胞參與不同的樹突生長過程，有針對性及探索性的與光感受器建立連接，并粘附在不同的突觸區(qū)域。同時，每種突觸類型都在同一時間尺度上建立同一傳入方式的最終連接模式。這種不同的策略和時間安排的模式，可以促進(jìn)多個突觸后細(xì)胞類型的共同傳輸，從而產(chǎn)生不同功能的平行電路。研究還表明，在發(fā)育過程中光感受器和雙極細(xì)胞之間突觸正確連接的分子機(jī)制在視錐通路和視桿通路之間存在差異[57]。Beier等[58]發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動物視網(wǎng)膜光感受器損傷后，健康的光感受器及其周圍的突觸終末端會橫向移向損傷區(qū)。雙極細(xì)胞可以重新建立與視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的連接，恢復(fù)視網(wǎng)膜明適應(yīng)和暗適應(yīng)的視覺敏感度。同時，視桿雙極細(xì)胞延長樹突，與損傷周圍正常的視桿光覺感受器形成新的突觸。而視錐雙極細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出明顯的樹突狀重組，其原因可能與視桿細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)和其代謝功能的敏感性有關(guān)[59]。這些發(fā)現(xiàn)表明不同的雙極細(xì)胞類型，代表不同的視覺通路，它們對光感受器喪失的反應(yīng)和由此產(chǎn)生的樹突狀結(jié)構(gòu)改變不同。但支持了雙極細(xì)胞重新與受損光感受器建立新的突觸的觀點(diǎn)，從而提高了視網(wǎng)膜變性導(dǎo)致失明患者視力恢復(fù)的可能。

7 展望

將小鼠、非人靈長類等實(shí)驗(yàn)動物作為對人類臨床治療探究的修正手段意義重大。隨著對哺乳動物視網(wǎng)膜的深入研究，綜合運(yùn)用免疫組化、生物物理學(xué)、藥理學(xué)、膜電容測定、熒光生物傳感器和雙光子顯微鏡等技術(shù)，視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞特征研究進(jìn)展十分迅速，其中免疫組化技術(shù)更為突出，這使得人們對視覺通路的一般組織原理有了更新、更深的認(rèn)識，從而將其“面紗”逐漸層層揭開。雙極細(xì)胞遠(yuǎn)不是簡單地將感光信號傳遞到視網(wǎng)膜內(nèi)部的等電位神經(jīng)元，而是實(shí)現(xiàn)視覺系統(tǒng)處理鏈中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。同時，隨著對雙極細(xì)胞突觸重塑的探尋發(fā)現(xiàn)，也鼓勵了通過對雙極細(xì)胞重新引入和改造來使視網(wǎng)膜疾病患者恢復(fù)視力的想法。然而，在成人視網(wǎng)膜中，識別相關(guān)突觸生長發(fā)育的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步漫長的研究。