澤瀉提取物對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的治療作用

龔 杰，丁 巖，干仲元，王慧雯，朱世敏，李漢清

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無(wú)過(guò)量飲酒史、飲酒折含乙醇量小于140 g/周(女性< 70 g/周)，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和肝硬化，胰島素抵抗和遺傳易感性與其發(fā)病關(guān)系密切[1]。中醫(yī)認(rèn)為病位在肝，病機(jī)特點(diǎn)以脾胃虛弱、肝郁氣滯、肝郁脾虛、腎精虧虛等為主，辨證以健脾化濕，疏肝健脾，化痰祛瘀等為治則，經(jīng)典方劑柴胡疏肝散、二陳湯、茵陳五苓散、香砂六君子湯等，用藥頻次較高者為山楂、澤瀉、柴胡、何首烏、郁金、半夏、陳皮、茯苓、虎杖、大黃等[2]。

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam)Juzep的干燥塊莖，冬季莖葉開(kāi)始枯萎時(shí)采挖，其性寒，味甘、淡，入腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂等功效，用于小便不利、水腫脹滿(mǎn)、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛、高脂血癥等病癥[3]?，F(xiàn)代研究表明澤瀉主要化學(xué)成分為三萜類(lèi)化合物(澤瀉醇A、澤瀉醇B及其衍生物)、倍半萜類(lèi)化合物(澤瀉醇，環(huán)氧澤瀉烯，澤瀉萜醇A，B，C，磺酰澤瀉醇A，B，C，D等)、二萜類(lèi)化合物以及一些類(lèi)脂和糖類(lèi)化合物；其主要藥理作用包括利尿，抗結(jié)石，抗高血壓、高血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化，抗脂肪肝，免疫調(diào)節(jié)等[4-8]。

嚴(yán)偉倫[9]報(bào)道了60例患者的臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)澤瀉調(diào)脂顆粒方能減輕脾虛痰瘀型非酒精性脂肪肝患者神疲乏力、食物不振、腹脹、四肢困倦、胸脅脹滿(mǎn)等癥狀，其作用機(jī)制包括有效改善非酒精性脂肪肝患者的各項(xiàng)血脂水平(TC、TG、LDL-C、HDL-C)以及有效降低非酒精性脂肪肝患者的轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)等。孫曉娜等[10]報(bào)道了100例患者的臨床試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)澤瀉泄?jié)犷w粒配合穴位貼敷能減輕非酒精性脂肪肝的嚴(yán)重程度，改善脂質(zhì)代謝，保護(hù)肝功能。

雖然澤瀉對(duì)于非酒精性脂肪肝的治療效果已經(jīng)明確，但是其作用機(jī)制報(bào)道較少。有研究表明脂質(zhì)過(guò)氧化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)因素，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的過(guò)程主要是由于缺氧、氧化應(yīng)激、錯(cuò)誤合成蛋白質(zhì)等多種因素誘發(fā)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，啟動(dòng)了有關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞蛋白合成，或者錯(cuò)誤合成蛋白，對(duì)不能修復(fù)的細(xì)胞則通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)細(xì)胞凋亡機(jī)制誘導(dǎo)其凋亡以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。過(guò)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)細(xì)胞能量耗竭、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡等機(jī)制使器官和組織產(chǎn)生損傷，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡是應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞損傷的主要機(jī)制。NAFLD發(fā)病機(jī)制的“二次打擊”假說(shuō)又表明氧化應(yīng)激造成的還原性谷胱甘肽水平下降可以引起JNK信號(hào)通路過(guò)度活化而誘導(dǎo)脂肪變性細(xì)胞死亡[11]。澤瀉作為臨床有效的抗脂肪肝藥物，不同的研究者做出了多方面探索，但卻沒(méi)有該方面機(jī)制的系統(tǒng)性研究。本文通過(guò)澤瀉提取物緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成肝細(xì)胞損傷，從而達(dá)到對(duì)非酒精性脂肪肝的治療作用。

本研究通過(guò)體外HepG2細(xì)胞脂肪變性模型及大鼠非酒精性脂肪肝模型，對(duì)澤瀉提取物作用后重要生化指標(biāo)、蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)地總結(jié)澤瀉對(duì)于非酒精性脂肪肝的藥理作用機(jī)制，為臨床用藥進(jìn)一步提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HepG2人肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。共16只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重(180±10) g，6 ～ 8周齡，由國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心暨上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[SCXK (滬) 2017-0005]。實(shí)驗(yàn)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樓SPF動(dòng)物房進(jìn)行[SYXK (滬) 2014-0008]，動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物房通風(fēng)鼠籠中，環(huán)境溫度控制在20℃ ～ 22℃，濕度為50%，12 h∶12 h光亮和光暗循環(huán)。SD大鼠共分為四組，每組4只，分別為對(duì)照組，400、200、100 mg/kg AOE組。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理編號(hào)：SZY201706008。所有操作均按照3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

澤瀉提取物由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究中心提供。澤瀉提取物的制備：將中藥澤瀉飲片成粗粉，分別用雙蒸水、50%甲醇和純甲醇煎煮，提取液濃縮回收，制備為澤瀉水浸膏、50%甲醇浸膏和澤瀉純甲醇浸膏。用含5%乙醇和7%聚丙烯醋酸纖維素鈉溶液作為澤瀉提取物增溶劑溶解浸膏，制得濃度均相當(dāng)于每毫升1.0 g澤瀉生藥的3種提取物混懸液。

油酸(貨號(hào)：O1383)、棕櫚酸購(gòu)自Sigma(貨號(hào)：P5585)；改良油紅O染色試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0008)、大鼠天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)ELISA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0117)、大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)ELISA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0116)、大鼠甘油三酯(TG)ELISA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0195)、大鼠高密度脂蛋白(HDL)ELISA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0197)、大鼠低密度脂蛋白(LDL)ELISA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0196)購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；Anti-JNK1(phospho T183)抗體(貨號(hào)：ab47337)、Anti-JNK1抗體[EPR140(2)](貨號(hào)：ab110724)、Anti-β-catenin抗體(貨號(hào)：ab16051)、Anti-GRP78 BiP抗體(貨號(hào)：ab140318)、Anti-DDIT3抗體[9C8](貨號(hào)：ab11419)、Anti-STAT3抗體[9D8](貨號(hào)：ab119352)和Anti-XBP1抗體(貨號(hào)：ab37151)購(gòu)自Abcam。

可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)，上海尤尼柯公司(型號(hào)：WFZ UV-2100)；低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司(型號(hào)：5430R)；600 V電泳儀，美國(guó)GE Healthcare公司(型號(hào)：EPS601)；SDS-PAGE電泳槽，北京六一公司(型號(hào)：DYCZ-24DN)；qPCR擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI公司(型號(hào)：ABI 7500)；病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司(型號(hào)：RM2016)；倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司(型號(hào)：Nikon Eclipse Ti-SR)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肝細(xì)胞脂肪變性模型建立

用油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞積累甘油三酯[12]。將油酸和棕櫚酸(OA∶PA=2∶1，摩爾比)混合后置于90°C以上水浴中加熱并不斷搖晃，5 ～ 10 min左右可完全溶解，趁熱移入DMEM完全培養(yǎng)基中，使油酸和棕櫚酸的終濃度為0.33 mol/L和0.17 mol/L。HepG2接種于孔板中，孵育過(guò)夜后，用DMEM低糖培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞饑餓12 h，然后換成含0.5 mol/L NEFA的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性。

1.3.2 Western blot實(shí)驗(yàn)

用混合脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性后，加入生理鹽水和不同濃度的澤瀉提取物處理24 h后，收集細(xì)胞，含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 min得到蛋白樣品。BCA法測(cè)定總蛋白含量。100℃金屬浴變性10 min后，加入loading buffer上樣，跑電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%牛奶封閉，按說(shuō)明書(shū)比例加入一抗及二抗，加入底物，化學(xué)發(fā)光儀器上觀察條帶并計(jì)算灰度值。

1.3.3 非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型建立

SD大鼠喂以高脂飼料(10%豬油+ 2%膽固醇+ 88%標(biāo)準(zhǔn)飼料)及飲水[13]，連續(xù)喂食8周。4只一組，分成四組，包括生理鹽水對(duì)照組及澤瀉提取物處理組(設(shè)置400、200、100 mg/kg澤瀉提取物分別為高、中、低劑量給藥組)。以灌胃方式給予藥物治療，每日2次，持續(xù)4周。對(duì)照組灌以生理鹽水。油紅染色陽(yáng)性即為建模成功。

1.3.4 大鼠血清及肝組織采集

給藥4周后，全體大鼠連續(xù)禁食12 h。稱(chēng)量體重，然后以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取新鮮血液10 mL，4℃、3000 r/min離心5 min，取上清用于ELISA法生化指標(biāo)測(cè)定；取血后，迅速解剖取得肝臟，PBS沖洗干凈血液后，置于含20倍體積TRIzol溶液的EP管中，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，用于總RNA提取、基因表達(dá)分析。

1.3.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

采集血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行含量測(cè)定。

1.3.6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

解剖所得肝組織加入20倍體積的TRIzol溶液并研磨。提取RNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 油紅染色

解剖所得肝組織在OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋后冰凍切片機(jī)切成15 μm的切片后，油紅染色判斷脂肪染色面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量結(jié)果采用多個(gè)樣本油紅染色面積為準(zhǔn)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色判斷脂肪肝模型

高脂飲食誘發(fā)非酒精性脂肪肝模型組織中脂肪含量增高，肝細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)脂滴多為大泡，多囊泡型，油紅O染色后，脂肪滴多呈片分布，水溶性封片劑封片后，脂滴常匯集在切片表面(見(jiàn)圖1)。

注：a：生理鹽水對(duì)照組；b：高脂飲食模型組；c：油紅染色相對(duì)染色面積定量結(jié)果。與對(duì)照組比較，**P< 0.01。圖1 油紅染色判斷脂肪肝模型(× 100)Note. a: Physiological saline control group; b: High-fat diet model group. c: Relative quantitative results of oil red staining. Compared with the control group,** P< 0.01.Figure 1 Evaluation of fatty liver model by oil red staining

2.2 Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白水平

作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的經(jīng)典標(biāo)記分子，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)會(huì)上調(diào)GRP78表達(dá)并且通過(guò)活化CHOP、JNK、caspase-12等通路誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[14-15]。IRE-1/XBP-1信號(hào)通路是高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)酶剪切作用活化XBP-1，后者的活化導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子表達(dá)增加[16-17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)抑制FAK-STAT3通路引發(fā)線(xiàn)粒體功能紊亂[17]。如圖2 ～ 3所示，澤瀉提取物處理后，JNK1、p-JNK1、GRP78、CHOP和XBP-1表達(dá)水平明顯下降(P< 0.01)，STAT3表達(dá)增加(P< 0.01)，并且呈劑量依賴(lài)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明澤瀉提取物可以抑制混合脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

注：a：各組p-JNK1、JNK1、STAT3表達(dá)水平；b：各組STAT3表達(dá)定量結(jié)果；c：各組JNK1表達(dá)定量結(jié)果；d：各組p-JNK1表達(dá)定量結(jié)果。對(duì)照組：0 mg/kg AOE；低劑量組：100 mg/kg AOE；中劑量組：200 mg/kg AOE；高劑量組：400 mg/kg AOE。與高劑量組比較，* P < 0.05，** P < 0.01。圖3、6、7同。圖2 AOE處理后p-JNK1、JNK1、STAT3表達(dá)水平Note. a: Expression of p-JNK1,JNK1 and STAT3 in each group. b: Quantitative results of STAT3 expression in each group. c: Quantitative results of JNK1 expression in each group. d: Quantitative results of p-JNK1 expression in each group. Control group: 0 mg/kg AOE; low-dose group: 100 mg/kg AOE; moderate-dose group: 200 mg/kg AOE; high-dose group: 400 mg/kg AOE. Compared with the high-dose group,* P < 0.05,** P < 0.01. The same in Figures 3, 6 and 7.Figure 2 Expression levels of p-JNK1,JNK1 and STAT3 after AOE treatment

注：a：各組GRP78、XBP-1、CHOP表達(dá)水平；b：各組GRP78表達(dá)定量結(jié)果；c：各組CHOP表達(dá)定量結(jié)果；d：各組XBP-1表達(dá)定量結(jié)果。圖3 AOE處理后GRP78、XBP-1、CHOP表達(dá)水平Note. a: Expression of GRP78，XBP-1 and CHOP in each group. b: Quantitative results of GRP78 expression in each group. c: Quantitative results of CHOP expression in each group. d: Quantitative results of XBP-1 expression in each group.Figure 3 Expression levels of GRP78,XBP-1 and CHOP after AOE treatment

2.3 透射電鏡結(jié)果

混合脂肪酸作用于HepG2細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生脂滴蓄積、空泡化等脂肪變性[19]。如圖4所示，經(jīng)過(guò)澤瀉提取物處理，脂肪變性HepG2細(xì)胞中脂滴減少。

注：a：HepG2澤瀉高劑量組(400 mg/kg AOE)；b：HepG2脂肪性病變組。箭頭指示肝細(xì)胞脂變。圖4 HepG2透射電鏡照片(× 3500)Note. a: HepG2 in the high-dose group (400 mg/kg AOE); b: HepG2 in the fatty degeneration group. Arrows indicate fatty degeneration of the liver cells.Figure 4 Transmission electron microscopy of HepG2

2.4 澤瀉提取物對(duì)SD大鼠肝脂肪性病變的影響

重度脂肪肝組織中脂肪含量高，肝臟組織細(xì)胞腫脹變形，通過(guò)高、中、低劑量的澤瀉治療后，從圖5中顯示，隨著藥物劑量濃度的增加，肝臟脂肪性病變隨之好轉(zhuǎn)。

注：a：生理鹽水對(duì)照組；b：澤瀉提取物100 mg/kg處理組；c：澤瀉提取物200 mg/kg處理組；d：澤瀉提取物400 mg/kg處理組。圖5 油紅染色檢測(cè)澤瀉提取物對(duì)SD大鼠肝脂肪性病變的影響(× 100)Note. a: Physiological saline control group; b: 100 mg/kg of AOE treatment group; c: 200 mg/kg of AOE treatment group; d: 400 mg/kg of AOE treatment group.Figure 5 Effect of AOE on hepatic steatosis of SD rats detected by oil red staining

2.5 ELISA結(jié)果

脂肪蓄積發(fā)生在非酒精性脂肪肝早期病程中。脂肪蓄積導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線(xiàn)粒體應(yīng)激反應(yīng)及自噬受損等脂毒性，以及TG、VLDL水平降低[20]。AST、ALT作為肝功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，其升高預(yù)示著肝損傷。非酒精性脂肪肝患者由于肝脂肪代謝紊亂會(huì)出現(xiàn)血清HDL降低和LDL升高[21-23]。如圖6結(jié)果所示，澤瀉提取物處理后，大鼠血清中AST、ALT、TG、LDL的表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性下降(P< 0.01)，SOD、HDL表達(dá)升高(P< 0.01)。結(jié)果表明，澤瀉提取物對(duì)非酒精性脂肪肝肝損傷具有治療作用。

注：a：ALT檢測(cè)水平；b：AST檢測(cè)水平；c：SOD檢測(cè)水平；d：TG檢測(cè)水平；e：HDL檢測(cè)水平；f：LDL檢測(cè)水平。圖6 ELISA檢測(cè)血清生化指標(biāo)Note. a: ALT detection level. b: AST detection level. c: SOD detection level. d: TG detection level. e: HDL detection level. f: LDL detection level.Figure 6 ELISA detection of serum biochemical indicators

2.6 RT-PCR結(jié)果

非酒精性脂肪肝會(huì)導(dǎo)致CYP2E1、CYP2A5上調(diào)表達(dá)[24-25]。如圖7結(jié)果顯示，澤瀉提取物處理后，肝組織內(nèi)CYP2E1、CYP2A5基因表達(dá)水平明顯下降(P< 0.01)，尤其是高劑量組。

注：a：CYP2E1基因表達(dá)水平；b：CYP2A5基因表達(dá)水平。圖7 RT-PCR檢測(cè)CYP2E1、CYP2A5基因表達(dá)水平Note. a: CYP2E1 gene expression level. b: CYP2A5 gene expression level.Figure 7 RT-PCR detection of CYP2E1 and CYP2A5 gene expression levels

3 討論

近年來(lái)，因生活方式改變、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩等，非酒精性脂肪肝的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[26]。30%的脂肪肝患者如果得不到有效治療會(huì)逐漸進(jìn)展成非酒精性脂肪性肝炎；如果病情繼續(xù)進(jìn)展，25%的非酒精性脂肪性肝炎可能發(fā)展成肝硬化或終末期肝病[27]，對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。

臨床研究資料表明，痰瘀互結(jié)為非酒精性脂肪肝(NAFLD)的重要發(fā)病機(jī)制。丹參具有活血祛瘀之功，澤瀉功能除水濕、消痰濁，兩藥為中醫(yī)臨床治療NAFLD過(guò)程中使用頻率較高的中藥[28]。三萜類(lèi)成分是澤瀉中的主要成分之一，在澤瀉的功效中起著非常重要的作用[29]。除了有效成分的確定，不同研究者從不同角度對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探索性研究。

李金海[30]通過(guò)對(duì)應(yīng)用異功澤瀉湯治療的52例非酒精性脂肪性肝炎患者及水飛薊賓膠囊治療的48例患者進(jìn)行對(duì)照觀察，發(fā)現(xiàn)異功澤瀉湯在降低血脂、改善肝功能等方面均優(yōu)于水飛薊賓膠囊，澤瀉可抑制外源性TG、TC的吸收，影響內(nèi)源性TC代謝及抑制TG肝內(nèi)合成，從而改善肝臟的脂肪代謝。王磊[31]通過(guò)對(duì)34例使用澤瀉飲合京三棱丸治療的非酒精性脂肪肝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)澤瀉飲合京三棱丸能有效改善TC、TG的水平，治療脂肪肝臨床療效顯著。姜國(guó)賢等[32]報(bào)道了32例口服調(diào)肝降脂(青蒿、柴胡、山楂、茯苓、澤瀉、法半夏、白芍、肉豆蔻、韭菜汁等)中藥治療非酒精性脂肪肝的臨床研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)澤瀉通過(guò)抑制外源性甘油三酯在肝內(nèi)的合成，影響與膽固醇代謝有關(guān)的酶及抑制肝內(nèi)甘油三酯合成等藥理作用而發(fā)揮抗脂肪肝效果。

隨后，又有不同的研究者從不同方面對(duì)澤瀉護(hù)肝功能進(jìn)行了研究。唐外姣[33]報(bào)道了護(hù)肝清脂片(由澤瀉、山楂、三七、蒲黃、荷葉及陳皮六味中藥組成)通過(guò)上調(diào)大鼠肝臟中沉默信息因子SIRT1的mRNA及其蛋白的表達(dá)，可以顯著改善胰島素抵抗，同時(shí)減緩氧化應(yīng)激/脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，抑制肝臟膠原沉積，有效調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂以及抑制肝臟脂質(zhì)沉積。Park等[34]報(bào)道了澤瀉乙醇提取物可以通過(guò)下調(diào)C/EBPβ表達(dá)，降低PPARγ和C/EBPβ表達(dá)水平來(lái)抑制OP9細(xì)胞脂肪分化。Jang等[35]報(bào)道了澤瀉塊莖甲醇提取物(MEAO)可以通過(guò)抑制肝脂肪生成基因、VLDLR等基因表達(dá)，增加ApoB分泌來(lái)減弱肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，阻止肝細(xì)胞病理性脂肪變性。曾璐[36]研究發(fā)現(xiàn)澤瀉醇A-24-醋酸酯能逆轉(zhuǎn)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞的TNF-α和IL-6水平的增加。郭雨雅[37]報(bào)道了加味澤瀉湯對(duì)可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB、MAPK信號(hào)通路上MyD88、NF-κB、P65、p-P65、P38、p-P38、MAPK蛋白的表達(dá)，抑制肝臟炎癥的產(chǎn)生、緩解肝臟的損傷，對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD模型有良好的治療效果。杜金梁等[38]報(bào)道了澤瀉提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)建鯉脂肪肝細(xì)胞損傷中生化指標(biāo)及CYP1A蛋白表達(dá)的影響。孫曉琦[39]報(bào)道了加味澤瀉湯可能通過(guò)改變NAFLD小鼠腸道微生物組成、改善腸粘膜屏障、降低肝臟內(nèi)炎癥因子表達(dá)及減輕肝臟炎癥來(lái)發(fā)揮作用。

其它關(guān)于非酒精性脂肪肝的治療機(jī)制研究也有很多，對(duì)澤瀉治療NAFLD的藥理作用機(jī)制研究有很大的參考意義。田衛(wèi)東[40]報(bào)道了阿托伐他汀能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善大鼠非酒精性脂肪肝肝臟損傷。鄭培永等[41]報(bào)道了強(qiáng)肝膠囊和辛伐他汀可能通過(guò)改善瘦素抵抗，增加肝臟瘦索受體mRNA表達(dá)及P-JAK2和P-STAT3蛋白水平而對(duì)NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)和炎癥有較好的治療作用。孫立云[42]報(bào)道了2 mmol/L DL-乙硫氨酸作用奶牛原代肝細(xì)胞24 h可成功制備脂肪變性肝細(xì)胞模型，10 μg/mL澤瀉作用48 h，可以降低肝細(xì)胞CYP450的表達(dá)，對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。楊文強(qiáng)等[43]報(bào)道了脂肪乳灌胃可以通過(guò)上調(diào)Wnt3α、β-catenin、Collal mRNA表達(dá)誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠肝纖維化。關(guān)麗嫦等[44]報(bào)道了高脂飲食可以通過(guò)誘導(dǎo)肝組織JNK1、p-JNK1蛋白表達(dá)水平升高，激活肝細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路同時(shí)抑制了脂聯(lián)素的生成，進(jìn)而產(chǎn)生和加重NAFLD。

這些研究都為澤瀉治療NAFLD作用機(jī)制探索提供了重要依據(jù)，但是仍然沒(méi)有澤瀉作用機(jī)制的系統(tǒng)性研究。本文系統(tǒng)性地研究闡明了澤瀉對(duì)非酒精性脂肪肝的治療機(jī)制。但是本研究仍然存在不足，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證澤瀉對(duì)肝細(xì)胞脂肪蓄積的緩解作用及其機(jī)制，因?yàn)橹拘罘e是肝損傷的根本原因。總之，本文通過(guò)研究不同濃度澤瀉對(duì)非酒精性脂肪肝血清生化指標(biāo)、JNK信號(hào)通路及脂肪變性肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響系統(tǒng)地研究了澤瀉治療NAFLD的作用機(jī)制，為澤瀉臨床治療NAFLD提供了重要理論依據(jù)。