FTIR技術(shù)結(jié)合區(qū)間偏最小二乘法快速測(cè)定油脂中反式脂肪酸

葉 沁 潘丹杰 栗 磊 楊志成 孟祥河

(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院1, 杭州 310014) (杭州市糧油中心檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)站2, 杭州 310009)

FTIR技術(shù)結(jié)合區(qū)間偏最小二乘法快速測(cè)定油脂中反式脂肪酸

葉 沁1潘丹杰2栗 磊1楊志成2孟祥河1

(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院1, 杭州 310014) (杭州市糧油中心檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)站2, 杭州 310009)

研究了傅里葉紅外光譜技術(shù)結(jié)合區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)快速分析食用油中低含量(0.1%～5%)反式脂肪酸的分析方法。通過系統(tǒng)地比較衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)及衰減透射紅外光譜法(TR-FTIR)光譜的模型效果，優(yōu)化建模區(qū)間。研究結(jié)果表明，ATR-FTIR、TR-FTIR-PLS回歸模型均能有效測(cè)定油脂中低濃度反式脂肪酸的含量，但TR-FTIR法靈敏度優(yōu)于ATR-FTIR法。iPLS區(qū)間選擇結(jié)果顯示，以1 000～940 cm-1波段透射光譜建模，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 8，標(biāo)準(zhǔn)集的RMSEC 0.016 6，驗(yàn)證集RMSEP為0.008 75，預(yù)測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.92%，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值高度相關(guān)，Y預(yù)測(cè)=1.00X實(shí)際-0.003 44，R2=0.998 7。12組外部驗(yàn)證試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.80%，說明預(yù)測(cè)精確度較高、模型穩(wěn)定性好，有潛力替代傳統(tǒng)氣相色譜法用于油脂中低含量反式脂肪酸快速定量測(cè)定。

FTIR iPLS 反式脂肪酸 油脂

反式脂肪酸(TFAs)是一類分子結(jié)構(gòu)中含有非共軛反式雙鍵的不飽和脂肪酸[1]。研究表明，TFAs與血脂代謝，血管炎癥和心腦血管疾病的發(fā)展變化之間有很強(qiáng)的相關(guān)性[2]。傳統(tǒng)的油和脂肪中反式脂肪酸的分析一般采用氣相色譜(GC)技術(shù)。該方法準(zhǔn)確度高，但需要脂類衍生化處理，耗時(shí)長(zhǎng)，需要昂貴的標(biāo)品及良好的試驗(yàn)技能。與此相反，快速的測(cè)定方法，例如近紅外，拉曼和中紅外光譜(FTIR)也被應(yīng)用于食物中脂肪酸的 分析[3-5]。

傅里葉變換中紅外光譜法克服了傳統(tǒng)的化學(xué)法需要甲酯化、使用有毒性、有害試劑等缺點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性高，時(shí)間短。其不足是靈敏度低，不適合于TFAs含量小于0.5%的樣品。本試驗(yàn)對(duì)比研究了FTIR透射光譜與ATR-FTIR光譜快速定量分析TFAs技術(shù)，同時(shí)結(jié)合區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)優(yōu)化了定量模型，開發(fā)了低TFAs含量樣品的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

反式亞油酸甲酯C18:2(純度≥99%)：美國(guó)Nu Check公司；正己烷(色譜純)：美國(guó) Tedia 公司；精煉大豆油、菜籽油、花生油：市售。

BRUKER TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀(配有ATR采樣系統(tǒng)、TR樣品池、OPUS 操作軟件)：德國(guó)布魯克公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

將反式脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品分別按比例溶于大豆油、菜籽油和花生油中。用作標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的反式亞油酸甲酯的加入比例分別為：5%、3%、1%、0.7%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.15%、0.1%、0.05%，共得36個(gè)校正集樣品。精確配置成總體積為5 mL的混合溶液，搖勻，靜置后備用。精確移取1 mL配置好的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用5倍(V/V)色譜級(jí)的正己烷稀釋，搖勻，靜置后作為透射標(biāo)準(zhǔn)樣品備用。另配置11個(gè)樣品作為驗(yàn)證集，反式亞油酸甲酯加入比例為5%、3%、1%、0.7%、0.4%、0.2%、0.1%，隨機(jī)溶于大豆油、菜籽油和花生油中，搖勻靜置后，同樣精確量取1 mL，分別以1∶5稀釋混勻。

1.3 紅外光譜的采集

全反射樣品的采集，取適量樣品均勻地涂在ATR 附件的晶體材料(ZnSe) 上，使其完全覆蓋晶體表面，OPUS軟件記錄4 000～400 cm-1的吸收光譜，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次，測(cè)量環(huán)境的濕度需小于70%，溫度保持在25 ℃。

透射樣品的采集，樣品池用色譜純正己烷潤(rùn)洗5遍后，用待測(cè)樣品潤(rùn)洗3遍，上樣， 記錄光譜。

1.4 模型的建立

采用TQ Analyst光譜分析軟件對(duì)所得紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理及分析，通過對(duì)紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，可以優(yōu)化所建立的模型。預(yù)處理方式一般包括一階導(dǎo)數(shù)，二階導(dǎo)數(shù)，自動(dòng)平滑等。在光譜采集過程中，光譜噪聲會(huì)造成偏最小二乘法出現(xiàn)微小偏差，影響模型的穩(wěn)定性。因此，本研究采用將光譜采集后自動(dòng)平滑，從而提高模型的穩(wěn)定性。

1.5 模型穩(wěn)定性的驗(yàn)證

對(duì)于所建的模型，需要對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。將反式亞油酸甲酯隨機(jī)溶于大豆油、菜籽油和花生油，摻入比例隨機(jī)配制12個(gè)預(yù)測(cè)集樣品。主要預(yù)測(cè)指標(biāo)有校正相關(guān)系數(shù)(R)，交叉驗(yàn)證誤差均方根(RMSECV)，預(yù)測(cè)均方差(RMSEP)，預(yù)測(cè)相對(duì)偏差(RPD)。

1.6 區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)

選擇合適的波段能使所建立的模型具有更好的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)將采用區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)對(duì)光譜波段進(jìn)行優(yōu)化。區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)建模是根據(jù)偏最小二乘法回歸模型將譜圖波段分成更小的區(qū)間。將每個(gè)子區(qū)間計(jì)算所得的交叉驗(yàn)證誤差均方根(RMSECV)與全波段下的數(shù)值相比，然后選擇所得RMSECV較小的子區(qū)間[6]。該方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是采用局部回歸建模的方法，主要體現(xiàn)在根據(jù)比較每一個(gè)子區(qū)間的模型和全波段模型比較，最后選擇確定最優(yōu)區(qū)間[7-8]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用 TQ Analyst 光譜分析軟件進(jìn)行定標(biāo)模型的建立，建立導(dǎo)入的預(yù)測(cè)樣品根據(jù)建立的模型進(jìn)行數(shù)學(xué)運(yùn)算從而得出預(yù)測(cè)樣品的反式脂肪酸的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用油的紅外吸收光譜

由于孤立反式雙鍵中CH官能團(tuán)的平面振動(dòng)變形，反式脂肪酸在966 cm-1處表現(xiàn)特征吸收，吸收強(qiáng)度和反式脂肪酸在油樣中的含量相關(guān)[11]。隨著反式亞油酸甲酯含量的增加，966 cm-1處的吸收峰也隨之增加，吸收強(qiáng)度也隨之變大。

b 1∶5不同反式脂肪酸含量的食用油、正己烷溶液的TR-FTIR光譜圖

圖1 食用油中定量添加反式脂肪酸的紅外光譜圖

2.2 模型的優(yōu)化

2.2.1 經(jīng)典PLS

根據(jù)各特征官能團(tuán)所在的波段，將全反射及透射光譜(4 000～600 cm-1)分為6個(gè)波段，其相應(yīng)區(qū)間所對(duì)應(yīng)的特征官能團(tuán)及建模結(jié)果見表1。研究采用交叉驗(yàn)證誤差均方根(RMSECV)，預(yù)測(cè)方差(RMSEP)以及相關(guān)系數(shù)(R) 3項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示無論是全反射法還是透射法均是基于990～920 cm-1波段所建立的模型較好，其R值最接近1，且RMSECV最小，但RPD的值均偏高，所建立模型并不理想。

表1 ATR和TR經(jīng)驗(yàn)PLS波段選擇結(jié)果

注：RMSECV：交叉驗(yàn)證誤差均方根， RMSEP：預(yù)測(cè)方差，R：相關(guān)系數(shù)，RPD：預(yù)測(cè)相對(duì)偏差，余同。

表2 ATR和TR區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)波段選擇結(jié)果

2.2.2 iPLS

因此本試驗(yàn)引入?yún)^(qū)間偏最小二乘法(iPLS)對(duì)全反射和透射波譜的最優(yōu)波段進(jìn)行選擇。全波段(4 000～600 cm-1)依次分成10、20、34、43、58個(gè)區(qū)間，依次建模，結(jié)果見表2。從表2中可以看出，在全反射和透射中，最優(yōu)建模區(qū)間均為1 000～940 cm-1(全波段分為58個(gè)區(qū)間)。在此波段上，利用全反射光譜建模所得RMSECV為0.076，RMSEP為0.090 5，R為0.998 8，利用透射建模所得RMSECV為 0.016 6，RMSEP為0.008 75，R為0.998 8。但透射的RPD值(2.92%)小于全反射RPD值(8.24%)。由此可以看出波譜區(qū)間選擇對(duì)提高模型穩(wěn)定性的重要性。

2.3 模型的驗(yàn)證和預(yù)測(cè)

選取按一定比例添加反式亞油酸甲酯的大豆油、菜籽油、花生油共11組，作為驗(yàn)證集，采用基于iPLS-58區(qū)間的FTIR/ATR和FTIR/TR最優(yōu)模型進(jìn)行驗(yàn)證。預(yù)測(cè)效果如圖2所示。TFAs的預(yù)測(cè)結(jié)果均與實(shí)際值高度相關(guān)，斜率均為1，截距接近0，說明開發(fā)的TFAs的FTIR/TR、ATR/FTIR分析模型準(zhǔn)確度較高。于修燭等[12]，陶健等[11]分別探討了FTIR-ATR技術(shù)結(jié)合二階導(dǎo)光譜測(cè)定油脂中反式脂肪酸，得到了較好的結(jié)果，但其主要針對(duì)TFAs含量高于0.5%的樣品。本研究開發(fā)的FTIR透射光譜與ATR-FTIR光譜模型均可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)低TFAs含量，尤其適合TFAs小于0.5%的樣品。

圖2 樣品標(biāo)準(zhǔn)集和預(yù)測(cè)集擬合曲線

2.4 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

隨機(jī)配制12組低反式亞油酸甲酯含量的樣品驗(yàn)證分析模型的準(zhǔn)確性，見表3。其中FTIR/ATR模型預(yù)測(cè)組的平均相對(duì)誤差為6.34%；FTIR/TR預(yù)測(cè)組為4.80%。da Costa Filho[13]采用FTIR-ATR結(jié)合偏最小二乘法(PLS)技術(shù)檢測(cè)食用油中小于1%的反式脂肪酸含量，所得相關(guān)系數(shù)為0.982。黃向榮[14]等采用氣相色譜法測(cè)定50份動(dòng)物油脂中的反式脂肪酸(5.15%～7.67%)，相應(yīng)RSD為3.52%～4.63%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究所采用的全反射傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜法結(jié)合區(qū)間偏最小二乘法不僅避免了GC法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的樣品前處理，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了油脂中低含量(<0.5%)反式脂肪酸的檢測(cè)，準(zhǔn)確度較高。此外，數(shù)據(jù)顯示TR-FTIR法的準(zhǔn)確度優(yōu)于ATR-FTIR法。

表3 ATR準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

建立了基于傅里葉變換紅外光譜技術(shù)的油脂反式脂肪酸的快速測(cè)定方法，分析時(shí)間從傳統(tǒng)GC方法的2～3 h縮短到3～5 min。經(jīng)分析比較發(fā)現(xiàn)，水平衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法和透射傅里葉變換紅外光譜法均可以用于反式脂肪酸含量的快速測(cè)定。其中，透射法線性關(guān)系和準(zhǔn)確度明顯更好，且靈敏度也較高，對(duì)反式脂肪酸含量<0.5%以下的樣品亦有較高的參考價(jià)值。在模型建立方面，無論是全反射法還是透射法均是基于1 000～940 cm-1波段所建立的模型預(yù)測(cè)效果更好，其中ATR-FTIR組的R值為0.998 8，RMSECV為0.076，TR-FTIR組的R值為0.998 8，RMSECV為0.016 6。與經(jīng)典的GC法相比，省略了繁瑣的脂肪酸皂化、甲脂化等樣品前處理過程，且實(shí)驗(yàn)成本也大大降低，測(cè)定和計(jì)算過程也簡(jiǎn)化了很多。

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Rapid Determination of Trans-Fatty Acids in Oils and Fats by FTIR Technology Combined with IntervalPartial Least Squares

Ye Qin1Pan Danjie2Li Lei1Yang Zhicheng1Meng Xianghe1

(Ocean College，Zhejiang University of Technology1，Hangzhou 310014)(Hangzhou Grain and Oil Center Inspection Station2，Hangzhou 310009)

In order to rapidly analyze the low level (0.1%～5%) trans fatty acids in edible oils, FTIR technology combined with interval partial least squares is studied in this paper. The effects of attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and Fourier transform infrared spectroscopy (TR-FTIR) models are systematically compared for optimization of spectral modeling interval. The results show that both ATR-FTIR regression model and TR-FTIR-iPLS regression model are effective in term of determination of low level trans fatty acids in oils. However, TR-FTIR method has higher sensitivity than that of ATR-FTIR method. The results of iPLS interval selection demonstrate that when transmission spectra model is established based on 1 000～940 cm-1, coefficient of correlationR2(0.998 8), RMSEC of 0.016 6, RMSEP of 0.008 75 and relative standard deviation of 2.92% are obtained. The FTIR/TR predictive values are highly correlated with the actual values with a regression equation ofYprediction= 1.00Xactuality-0.003 44,R2=0.998 7. The relative standard deviation of 12 groups of external validation tests (4.80%) shows that the model has higher prediction accuracy, and better stability. It is potential for TR/FTIR-iPLS method to be taken as an alternative to the traditional gas chromatography for rapid determination of low concentration of trans fatty acids in oils.

FTIR，iPLS，trans fatty acid，oil，determination

TQ646.4

A

1003-0174(2016)10-0137-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(31271887)，杭州市社會(huì)發(fā)展科研專項(xiàng)( 20140533B20)

2015-02-07

葉沁, 女，1989年出生,碩士，油脂分析檢測(cè)

孟祥河，男，1974年出生，教授，糧油深加工技術(shù)