酶法制備板栗緩慢消化淀粉的工藝優(yōu)化

趙 媛 呂 佼 邱增蓮 歐陽杰 王建中 王豐俊

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

酶法制備板栗緩慢消化淀粉的工藝優(yōu)化

趙 媛 呂 佼 邱增蓮 歐陽杰 王建中 王豐俊

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

以板栗淀粉為原料，采用普魯蘭酶進(jìn)行脫支處理制備緩慢消化淀粉(SDS)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，以提高SDS的含量。制備板栗緩慢消化淀粉的最優(yōu)工藝條件是：淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，普魯蘭酶濃度8.90 PUN/g淀粉，酶作用時(shí)間6.3 h，4 ℃回生52.2 h。在最佳工藝條件下，通過葡萄糖氧化酶法進(jìn)行測定，酶改性的板栗淀粉中緩慢消化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)41.91%(預(yù)測值42.31%)，并較板栗原淀粉中緩慢消化淀粉含量提高了5.43倍。試驗(yàn)表明，普魯蘭酶脫支處理是制備板栗緩慢消化淀粉的有效方法。

板栗 緩慢消化淀粉 普魯蘭酶 響應(yīng)面優(yōu)化

淀粉是人類生理能量和營養(yǎng)攝入的主要來源之一，可通過人體小腸的消化吸收提供能量。根據(jù)淀粉的生物可利用性，Englyst等[1]將淀粉分為3類：易消化淀粉(ready digestible starch, RDS)、緩慢消化淀粉(slowly digestible starch, SDS)和抗性淀粉(resistant starch, RS)。其中緩慢消化淀粉(SDS) 從營養(yǎng)學(xué)角度定義為在 pH 5.2 和 37 ℃條件下，20～120 min內(nèi)被混合酶(胰 α-淀粉酶、糖化酶與轉(zhuǎn)化酶)消化的淀粉片斷。近年來，抗性淀粉(RS)的研究已逐漸成熟，而緩慢消化淀粉(SDS)因其可維持餐后血糖并持續(xù)提供能量、增加飽腹感，有利于對糖尿病、心腦血管疾病及肥胖病人的病情進(jìn)行調(diào)節(jié)和控制的特點(diǎn)[2]，日益成為食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，有學(xué)者研究了采用物理、化學(xué)及生物酶改性不同植物源淀粉來制備緩慢消化淀粉的方法[3-7]。板栗作為良好的淀粉資源，目前開發(fā)利用較少，已有的研究包括采用化學(xué)方法進(jìn)行淀粉磷酸酯化的改性和低壓處理對淀粉性質(zhì)改變的研究[8-10]，而針對淀粉消化能力的研究甚少，因此板栗可作為研究淀粉改性加工的原材料，一方面板栗淀粉中含有較高的支鏈淀粉(54%～72%)[11]，另一方面，板栗原淀粉中RS含量雖很高，但經(jīng)加熱糊化多轉(zhuǎn)變?yōu)镽SD，采用酶法脫支處理及老化回生可高效促進(jìn)淀粉重結(jié)晶，提高淀粉中SDS的含量。因此，本研究以板栗淀粉為主，采用普魯蘭酶進(jìn)行脫支處理，通過研究酶作用體系的條件探索板栗緩慢消化淀粉的最佳制備工藝，為板栗淀粉在食品行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用及SDS產(chǎn)品的商業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板栗：河北省遷西縣燕山早豐；Type VI-B 豬胰α-淀粉酶(19.6 U/mg)：日本和光純藥wako公司；GL-L NEW 黑曲霉糖化酶(100 000 U/g)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；普魯蘭酶(1 350 PUN/mL) (1 PUN是指在pH 5.0、溫度40 ℃、作用0.2%普魯蘭30 min的標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解普魯蘭釋放出帶有相當(dāng)于1 μmol分子量葡萄糖還原力的還原碳水化合物的酶的數(shù)量)：諾維信公司；E1010葡萄糖氧化酶(GOD)法測定試劑盒：普利萊基因技術(shù)有限公司。

KHB-ST-360酶標(biāo)儀：上?？迫A生物工程股份有限公司；SHA-BA水浴恒溫振蕩器：金壇市榮華儀器制造有限公司；BLENDER800S組織破碎機(jī)：WARING COMMERCIAL；JB-3型定時(shí)雙向磁力恒溫?cái)嚢杵鳎航K省金壇市榮華儀器制造有限公司；TD5A臺式低速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 板栗淀粉的提取工藝

板栗→去殼去衣→破碎→0.2%NaOH溶液浸泡12 h→依次過80目、200目篩除渣→濾液離心(4 000 r/min，5 min)→蒸餾水水洗沉淀3～4次→-60 ℃冷凍干燥→板栗淀粉

1.2.2 板栗緩慢消化淀粉的制備工藝

參照Guraya等[12]、熊珊珊[13]的方法，設(shè)計(jì)板栗緩慢消化淀粉的制備流程：

用pH 5.4的磷酸鹽緩沖液配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的淀粉乳(3.25%～10.25%)→100 ℃水浴，充分糊化1 h→冷卻至57.5 ℃→加入普魯蘭酶[2～18 PUN/g淀粉]→57.5 ℃，180 r/min水浴振蕩(3～24 h)→100 ℃ 30 min滅酶→冷卻→加入無水乙醇促沉淀→4 ℃回生(12～72 h)→離心(4 000 r/min, 8 min)去上清液→水洗3次→取沉淀冷凍干燥→板栗緩慢消化淀粉(SDS)。

1.2.3 葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照E1010葡萄糖氧化酶(GOD)法測定試劑盒說明中標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和測定方法，以吸光度為橫坐標(biāo)x，葡萄糖含量為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程y=235.53x+0.330 9(R2=0.999 9)。

1.2.4 緩慢消化淀粉含量的測定

根據(jù)繆銘等[14]改進(jìn)優(yōu)化的Englyst體外SDS含量分析法進(jìn)行淀粉消化模擬試驗(yàn)：稱取200 mg 淀粉樣品置于50 mL錐形瓶中，添加15 mL pH 5.2 的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液，混勻后加入10 mL的豬胰α-淀粉酶(290 U/mL)和糖化酶(15 U/mL)，置于37 ℃恒溫水浴下振蕩(180 r/min) 并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)。水解20min 或120 min 后取出0.5 mL 水解液加4 mL無水乙醇加熱滅酶，冷卻后定容離心，取上清液用葡萄糖氧化酶法在492 nm下比色測定產(chǎn)生的葡萄糖含量，推算緩慢消化淀粉的含量。具體計(jì)算公式：

RDS(%)=(G20-FG)×0.9/TS

SDS(%)=(G120-G20)×0.9/TS

RS(%)=[TS-(RDS+SDS)]/TS

式中：G20為淀粉酶水解 20 min 后產(chǎn)生的葡萄糖含量/mg；FG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖含量/mg；G120為淀粉酶水解120 min 后產(chǎn)生的葡萄糖含量/mg；TS為樣品中總淀粉含量/mg。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

選擇普魯蘭酶濃度、淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶作用時(shí)間、4 ℃回生時(shí)間為單因素變量，考察各因素對緩慢消化淀粉含量的影響，確定各因素的最佳水平，為響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素提供數(shù)據(jù)支持。

1.2.5.1 普魯蘭酶濃度對制備所得板栗SDS含量的影響

配制15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.75%的淀粉乳6份，普魯蘭酶濃度分別取0、2、6、10、14、18 PUN/g淀粉6個水平，在57.5 ℃ 180 r/min條件下水浴振蕩6 h，滅酶加乙醇，4 ℃回生48 h，離心洗滌凍干，考察普魯蘭酶濃度對板栗SDS含量的影響。

1.2.5.2 淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對制備所得板栗SDS含量的影響

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.25%、5.00%、6.75%、8.50%、10.25% 5個水平的淀粉乳各15 mL，加入10 PUN/g淀粉的普魯蘭酶，在57.5 ℃ 180 r/min條件下水浴振蕩6 h，滅酶加乙醇，4 ℃回生48 h，離心洗滌凍干，考察淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對板栗SDS含量的影響。

1.2.5.3 不同酶作用時(shí)間對制備所得板栗SDS含量的影響

配制15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.75%的淀粉乳6份，加入10 PUN/g淀粉的普魯蘭酶，在57.5 ℃ 180r/min條件下水浴振蕩，酶作用時(shí)間分別取0、3、6、9、12、24 h 6個水平，滅酶加乙醇，4 ℃回生48 h，離心洗滌凍干，考察酶作用時(shí)間對板栗SDS含量的影響。

1.2.5.4 不同回生時(shí)間對制備所得板栗SDS含量的影響

配制15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.75%的淀粉乳6份，加入10 PUN/g淀粉的普魯蘭酶，在57.5 ℃ 180 r/min條件下水浴振蕩6 h，滅酶加乙醇，4 ℃回生，回生時(shí)間分別取12、24、36、48、60、72 h 6個水平，結(jié)束后離心洗滌凍干，考察回生時(shí)間對板栗SDS含量的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

為分析各影響因素間的交互作用對制備所得板栗緩慢消化淀粉(SDS)含量的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用 Design Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示，分別選取以普魯蘭酶濃度、淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶作用時(shí)間、回生時(shí)間為試驗(yàn)因素，以酶改性后板栗淀粉中緩慢消化淀粉(SDS)的含量為響應(yīng)值，確定最佳制備條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.2.7 不同板栗淀粉消化性能的測定與對比

為更好地了解普魯蘭酶作用板栗淀粉后淀粉消化性能的變化，采用響應(yīng)面試驗(yàn)最優(yōu)條件制備的板栗淀粉與板栗原淀粉、板栗糊化淀粉進(jìn)行消化性能的對比，分析板栗淀粉中易消化淀粉(RDS)、緩慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)含量的變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用Excel 2013，Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)測定結(jié)果

2.1.1 普魯蘭酶濃度對制備所得板栗SDS含量的影響

由圖1可得，經(jīng)普魯蘭酶脫支反應(yīng)后所得淀粉，其緩慢消化淀粉的含量較未加入脫支酶的緩慢消化淀粉有所提升，且緩慢消化淀粉的含量隨著加入酶濃度的增加而先呈現(xiàn)增加趨勢，在6 PUN/g淀粉時(shí)達(dá)到最大，隨著濃度的繼續(xù)增加，SDS含量反而有所下降，可能原因?yàn)楦邼舛鹊钠蒸斕m酶脫支淀粉支鏈形成較多小分子鏈，這些小分子鏈在回生重結(jié)晶過程中重新排列組合，形成緊密結(jié)晶區(qū)，使得SDS含量下降，抗性淀粉(RS)含量上升。這個結(jié)果趨勢與繆銘等[14]研究的結(jié)論相一致。

圖1 普魯蘭酶濃度對板栗淀粉消化性能的影響

2.1.2 淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對制備所得板栗SDS含量的影響

由圖2可以看出，相同酶作用條件下，不同淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品所產(chǎn)生的SDS含量是不一樣的，并在淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.75%時(shí)所得板栗淀粉中SDS含量最高。因?yàn)椴煌|(zhì)量分?jǐn)?shù)的淀粉乳，其含水量影響淀粉的糊化和回生，含水量越高，水分子參與重結(jié)晶的越多，有利于不定型區(qū)的形成，而水分含量相對較少時(shí)，淀粉回生慢，能夠形成更加緊密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致緩慢消化淀粉的減少，抗性淀粉的增加，這與丁文平等[15]研究含水量對大米淀粉糊化和回生的影響得出的水分子含量越低參與抗酶解能力越強(qiáng)的結(jié)論有一定相似之處，當(dāng)然，具體原因應(yīng)在之后的研究中具體開展。

圖2 淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對板栗淀粉消化性能的影響

2.1.3 不同酶作用時(shí)間對制備所得板栗SDS含量的影響

由圖3可得，SDS 含量隨著脫支時(shí)間的延長呈先增加后降低的趨勢，在酶作用6 h時(shí)達(dá)到最高。這說明恰當(dāng)?shù)拿撝r(shí)間可以增加SDS含量，如果過長，不利于緩慢消化淀粉不定型區(qū)的形成，會導(dǎo)致淀粉鏈的進(jìn)一步水解重結(jié)晶，形成較多的抗性淀粉。這與Guraya等[12]報(bào)道的酶解蠟質(zhì)玉米淀粉最佳酶解時(shí)間4 h以及Shin等[16]報(bào)道的蠟紙高粱淀粉最佳酶解時(shí)間為8 h的結(jié)論相一致。

圖3 酶解時(shí)間對板栗淀粉消化性能的影響

2.1.4 不同回生時(shí)間對制備所得板栗SDS含量的影響

在預(yù)試驗(yàn)中，探究了回生時(shí)間從0 h起板栗淀粉中SDS含量的變化是持續(xù)上升的。在確定最佳回生時(shí)間時(shí)，如圖4所示，主要考察淀粉溶液在以12 h為單位的回生時(shí)間梯度下，所得板栗SDS含量隨著時(shí)間延長而變化，并在48 h處達(dá)最大值。根據(jù)Fredri-ksson等[17]的研究表明，淀粉回生分為短期回生和長期回生，短期回生主要是由直鏈淀粉的膠凝有序和結(jié)晶所引起的；長期回生(以天計(jì))則主要是由支鏈淀粉外側(cè)鏈的重結(jié)晶所引起的，該過程是一個緩慢長期的過程，能夠形成較多的緩慢消化淀粉。當(dāng)回生時(shí)間超過48 h后，SDS含量有所下降，進(jìn)一步計(jì)算得淀粉中抗性淀粉含量增加，可能原因是淀粉分子鏈間繼續(xù)發(fā)生了相互作用。

圖4 回生時(shí)間對板栗淀粉消化性能的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

采用Design Expert 8.0軟件，對表 2 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出板栗緩慢消化淀粉(SDS)含量Y的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=39.64+3.49A+2.77B+1.78C+1.70D+2.45AB-1.16AC+1.35AD-0.58BC-0.39BD+2.00CD-3.90A2-2.94B2-5.45C2-3.76D2

對方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析表

注：**代表 0.01 顯著水平。

模型的一次項(xiàng)A、B、C、D影響極顯著，交互項(xiàng)AB、CD影響極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響達(dá)極顯著水平，通過回歸分析可知，各因素對板栗緩慢消化淀粉(SDS)的含量均有顯著性影響，且影響順序?yàn)槠蒸斕m酶濃度(A)>淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)>酶作用時(shí)間(C)>回生時(shí)間(D)。

2.2.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件的確定

運(yùn)用Design Expert 8.0 軟件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，將4個因素兩兩交互作用進(jìn)行比較后可知，AB、CD交互作用極顯著。

根據(jù)模型分析計(jì)算可得，制備板栗緩慢消化淀粉的最佳工藝參數(shù)：淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.04%，普魯蘭酶濃度8.89 PUN/g淀粉，酶作用時(shí)間6.33 h，4 ℃回生52.16 h，SDS含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))預(yù)測最大值為42.31%。為便于操作，將制備工藝參數(shù)修正為：淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，普魯蘭酶濃度8.90 PUN/g淀粉，酶作用時(shí)間6.3 h，4 ℃回生時(shí)間52.2 h，經(jīng)過3次驗(yàn)證試驗(yàn)得改性后板栗SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值為41.91%，實(shí)際值與預(yù)測值的相對誤差為0.95%，說明模型優(yōu)化所得參數(shù)可靠，可用于板栗緩慢消化淀粉(SDS)的工藝優(yōu)化應(yīng)用。

2.3 板栗淀粉酶法處理前后消化性能的對比

由圖5可得，經(jīng)普魯蘭酶改性處理后的板栗淀粉，SDS的含量較板栗原淀粉、糊化淀粉中緩慢消化淀粉(SDS)含量提高了5.43倍和1.25倍。板栗糊化淀粉的易消化淀粉(RSD)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)70.05%，較原淀粉增加了58.43%，因?yàn)榘謇踉矸壑锌剐缘矸垡话銥榫哂兄旅芙Y(jié)構(gòu)和部分結(jié)晶結(jié)構(gòu)的RS2型[18]，其抗性隨著糊化完成而消失，形成有利于消化吸收的無定型結(jié)構(gòu)，消化性能得以提升；通過酶法改性的淀粉，不僅有無定型區(qū)的形成過程，而且在脫支后經(jīng)回生處理，促進(jìn)了利于SDS形成的重結(jié)晶，因此，改性后的板栗淀粉其SDS的含量較原淀粉和糊化淀粉都有相應(yīng)的增加，而RS的含量較原淀粉減少。

圖5 板栗淀粉酶法處理前后消化性能的對比

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，建立了酶法制備板栗緩慢消化淀粉最佳工藝的模型，并確定了酶法制備高SDS含量的改性板栗淀粉的工藝條件。得出制備板栗緩慢消化淀粉的最優(yōu)工藝條件：淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，普魯蘭酶濃度8.90 PUN/g淀粉，酶作用時(shí)間6.3 h，4 ℃回生52.2 h。在最佳工藝條件下，改性后板栗淀粉中緩慢消化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)41.91%(理論值42.31%)，并較板栗原淀粉、糊化淀粉中緩慢消化淀粉含量提高了5.43倍和1.25倍。此外，本研究對板栗緩慢消化淀粉的形成機(jī)理及抗性淀粉在改性中的含量變化進(jìn)行了簡單的比較和分析，下一步應(yīng)針對研究中酶解和回生過程中直/支鏈比的變化、SDS形成的機(jī)理以及如何將該工藝應(yīng)用到板栗淀粉的食品加工中做進(jìn)一步的研究與探索。

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Optimization of the Process on the Formation of Slowly Digestible Starch from Chestnut Starch

Zhao Yuan Lü Jiao Qiu Zenglian Ouyang Jie Wang Jianzhong Wand Fengjun

(Beijing Forestry University, College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing 100083)(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety, Beijing 100083)

Chestnut starch as raw materials was debranched with pullulanase to prepare slowly digestible starch (SDS). Single factor experiment and the response surface analysis were carried out in this paper to improve SDS content. The results indicated that the optimum preparation conditions were obtained as follows: the starch suspension mass fraction 8%, the pullulanase concentration 8.90 PUN/g starch, hydrolysis time 6.3 h and cooling at 4 ℃ for 52.2 h. Under the optimum conditions, determined by glucose oxidase method, the content of SDS (mass fraction) in modified chestnut starch was 41.91% (predicted value was 42.31%). Compared with the content of SDS in fresh chestnut starch, it was increased 5.43 times. The test indicated that pullulanase debranching treatment was an effective method for preparing slowly digestible starch.

chestnut starch, slowly digestible starch, pullulanase, response surface optimization

TS235.4

A

1003-0174(2016)10-0108-06

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201204401)

2015-01-16

趙媛, 女，1988年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程

王豐俊，男，1975年出生，副教授，林產(chǎn)品加工利用