女貞子及其活性成分抗骨質(zhì)疏松作用及途徑研究進展

陳 楠，李曉莉，張 巖

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所，上海 200032；2. 教育部“筋骨理論與治法”重點實驗室，上海 200032；3. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨量減少或(和)骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，造成骨脆性增加，容易發(fā)生骨折的全身代謝性骨病。目前，世界衛(wèi)生組織已將OP、糖尿病、阿爾茨海默病列為危害中老年人健康的三大殺手。隨著人口老齡化現(xiàn)象的出現(xiàn)，OP的發(fā)病率也不斷增加。全世界范圍內(nèi)，每3 s會發(fā)生1例骨質(zhì)疏松性骨折。我國是全球OP患者最多的國家，40歲以上人群約有1.12億患者，發(fā)病率高達19.74%[1]。目前，臨床針對OP的治療藥物并不多，且大多不良反應(yīng)比較嚴(yán)重，不能滿足現(xiàn)階段臨床需要。因此，從中草藥中尋找和開發(fā)新型抗OP藥物已經(jīng)成為熱門研究課題，并具有重要臨床意義。

女貞子為木犀科常綠喬木植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂其能“主補中，安五臟，養(yǎng)精神，除百病，久服肥健，輕身不老”，故列為上品?，F(xiàn)代研究表明，女貞子藥理作用主要包括降血糖、調(diào)血脂、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護、抗炎抑菌、抗細胞凋亡、保肝等[2]。近些年的基礎(chǔ)研究不斷深入，尤其在女貞子防治OP方面的研究取得突破進展[3]。本文依據(jù)國內(nèi)外文獻，對女貞子及其所含主要活性成分防治OP可能的作用途徑與機制進行綜述，為女貞子的進一步開發(fā)與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 女貞子防治OP的作用途徑

1.1調(diào)控鈣代謝-維生素D系統(tǒng)維生素D2和維生素D3是與人類健康緊密相關(guān)的維生素D(vitamin D, VD)的兩種營養(yǎng)分子，但這兩種成分體內(nèi)并無生物活性，需連續(xù)經(jīng)過肝臟25-羥化酶、腎臟1α-羥化酶(1-OHase)的作用，轉(zhuǎn)化為VD生物活性形式1,25-雙羥維生素D[1,25-(OH)2D]，可增加腸道鈣吸收，減少尿鈣排泄，維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，增強肌力，改善平衡。

Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)，女貞子可以促進活性維生素D3生物合成、調(diào)控維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)和鈣結(jié)合蛋白表達，促進腸鈣吸收，抑制高尿鈣排泄，提高老年♀大鼠、老年去卵巢大鼠[5]皮質(zhì)骨的骨礦含量(bone mineral content, BMC)、骨密度(bone mineral density, BMD)[6]，提高糖尿病小鼠松質(zhì)骨BMD[7]。據(jù)最近的兩篇綜述報道[8-9]，Zhang等是首次從中藥及天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)并系統(tǒng)研究了女貞子調(diào)控鈣代謝平衡、維生素D內(nèi)分泌代謝的研究團隊。隨后，Dong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物給藥后的假手術(shù)組大鼠、去卵巢(ovariectomized, OVX)組大鼠血清1,25(OH)2D3含量均明顯提高，同時提高了假手術(shù)組大鼠腎臟1-OHase和VDR的蛋白、mRNA表達，以及OVX大鼠腎臟1-OHase的蛋白表達；體外實驗中，女貞子提取物可以提高原代培養(yǎng)腎小管細胞1-OHase mRNA表達和活性，從而提高活性維生素D的生物合成，提高血液1,25(OH)2D3水平[7]，達到治療OP的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物可以上調(diào)處于生長期的♂大鼠[11]、♀大鼠[12]十二指腸黏膜鈣主動轉(zhuǎn)運蛋白，如鈣結(jié)合蛋白表達，從而提高腸鈣吸收，增加骨量，改善骨的性能。

1.2調(diào)控OPG-RANKL-RANK通路骨保護蛋白(osteoprotegerin, OPG)、核因子-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)和核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的調(diào)控破骨細胞分化的通路，介導(dǎo)破骨細胞參與的骨吸收作用和骨重建過程。在調(diào)控成熟破骨細胞生成過程中，當(dāng)破骨前體細胞膜的RANK與成骨細胞分泌的RANKL結(jié)合后，在腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子的參與下，啟動下游級聯(lián)信號傳導(dǎo)，最終誘導(dǎo)破骨細胞分化成熟，并且抑制破骨細胞凋亡。骨髓間充質(zhì)細胞和成骨細胞在產(chǎn)生RANKL的同時，也產(chǎn)生了OPG干擾RANKL信號傳導(dǎo)。OPG作為可溶性誘餌受體，競爭性地與RANKL結(jié)合，使其失去結(jié)合RANK的活性，負(fù)性調(diào)節(jié)RANKL-RANK的相互作用，從而抑制破骨細胞前體分化、存活與融合，誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，使骨吸收與骨形成達到一個相對平衡的狀態(tài)。因此，OPG-RANKL-RANK信號系統(tǒng)相互制約，綜合調(diào)控著骨密度和骨強度。

Lyu等[12]給大鼠分別喂飼具有女貞子提取物不同含量(0.40%、0.65%、0.90%)的AIN-93G飼料，16周后發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物明顯降低血清骨吸收標(biāo)志物CTX-I的含量，同時降低RANKL/OPG比值。有研究人員通過對RAW264.7小鼠巨噬細胞的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物可以通過抑制RANKL通路來減少破骨細胞，降低RANKL/OPG比值，達到抗骨質(zhì)疏松的作用[13]。Li等[14]使用女貞子水提取物處理MC3T3-E1成骨細胞，發(fā)現(xiàn)女貞子對成骨細胞存活率不僅存在著濃度依賴性，還存在時間依賴性，此外，通過ERK、p38、Akt等信號通路，調(diào)控MC3T3-E1細胞OPG、RANKL分子的表達，從而影響破骨細胞的成熟。

1.3調(diào)控CaSR-PTH軸甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)是維持血鈣平衡的重要激素之一，可以促進鈣的重吸收，減少鈣從尿液中排泄，間接提高腸道對鈣的吸收，提高骨密度、骨強度和改善骨的微結(jié)構(gòu)。PTH的合成與分泌受位于甲狀旁腺的鈣敏受體(calcium-sensing receptor, CaSR)所調(diào)控，而CaSR的活性取決于血循環(huán)中Ca2+的濃度變化。Dong等[15]將4月齡成熟♀SD大鼠隨機分組，分別喂飼鈣含量為0.1%、0.6%、1.2%的低鈣、中鈣、高鈣飼料，發(fā)現(xiàn)女貞子水提物有效升高中鈣組、高鈣組大鼠血清PTH水平，減少尿鈣、糞鈣含量，維持體內(nèi)鈣平衡。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，女貞子水提物可明顯糾正糖尿病小鼠鈣代謝失衡，并將血清PTH水平提高46%，同時，通過調(diào)控腎臟CaSR的mRNA、蛋白表達，提高腎小管對鈣的重吸收能力。

1.4調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化女貞子可以促進成骨細胞的增殖，增加骨形成，改善骨代謝，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。通過女貞子水提取物對老年大鼠骨保護作用的機制研究[16]，發(fā)現(xiàn)女貞子能夠刺激骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向成骨細胞分化[17]，抑制其向脂肪細胞和破骨細胞分化。通過對女貞子的體內(nèi)、體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，女貞子可能是通過增加MSCs細胞外基質(zhì)、增加基質(zhì)蛋白質(zhì)合成、促進生長因子相關(guān)信號通路等途徑，促進MSCs向成骨細胞分化。隨后研究采用檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和礦化作用來評價MSCs的成骨分化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，女貞子可以明顯刺激ALP活性，縮短MSCs增殖分化時間，同時MSCs向成骨細胞分化過程中的部分調(diào)控因子表達也出現(xiàn)上調(diào)，最終發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

1.5抗氧化作用氧化應(yīng)激是人體內(nèi)的正常現(xiàn)象，參與體內(nèi)氧化-還原平衡的各種酶系統(tǒng)維持了生理狀態(tài)低水平活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。ROS作為細胞內(nèi)的氧化-還原信號分子，參與調(diào)控骨代謝，包括RANKL依賴的破骨細胞的分化。Wang等[18]將♀大鼠雙側(cè)卵巢切除后，按照大鼠重量每千克給予3.5 g女貞子水提物，灌胃處理12周，發(fā)現(xiàn)血清總抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)和一氧化氮水平增加，血清、脛骨、子宮丙二醛和8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)水平下降，而且脛骨和子宮腔內(nèi)的NOX4、NF-κB p65、p-IκBα的表達下調(diào)，這些實驗數(shù)據(jù)都表明女貞子具有一定的體內(nèi)抗氧化作用。在骨組織，女貞子可能通過抑制NOX4/ROS/NF-κB信號通路，達到抗骨質(zhì)疏松的作用，從而提供了另一條女貞子防治OP的可能作用途徑。

2 女貞子在復(fù)方中的應(yīng)用

中成藥二至丸，由女貞子和墨旱蓮兩味藥組成，其中女貞子為君藥，墨旱蓮為臣藥，各占50%，滋腎養(yǎng)肝，治療因肝腎陰虛導(dǎo)致的頭暈耳鳴、腰膝酸痛、失眠多夢等。Cheng等[19]對60只3月齡OVX大鼠進行隨機分組處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二至丸可以明顯抑制大鼠卵巢切除后引起的骨丟失和骨小梁微結(jié)構(gòu)改變，提高OVX大鼠血鈣、血磷水平。此外，二至丸能在一定程度上促進圍絕經(jīng)期婦女成骨細胞增殖分化。有學(xué)者基于UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，采用PCA和OPLS-DA方法分析了二至丸中女貞子與墨旱蓮配伍前后化學(xué)成分的變化，研究表明二者配伍前后成分含量差異明顯，主要的指標(biāo)性成份含量明顯升高，而且女貞子中的三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯醇類成分，以及墨旱蓮中的三萜皂苷類、黃酮類、有機酸類成分在兩藥配伍后溶出量增加，這對機體的吸收發(fā)揮重要作用，從化學(xué)成分含量變化的角度，初步揭示了女貞子與墨旱蓮藥對配伍的科學(xué)內(nèi)涵。

根據(jù)中醫(yī)藥理論，骨健康與腎功能密切相關(guān)，而腎虛被認(rèn)為是骨骼和骨關(guān)節(jié)相關(guān)疾病的根源。由于女貞子通常被用作補足腎陰虛，所以會和補足腎陽虛的淫羊藿組成復(fù)方，該復(fù)方可以通過減緩骨代謝來減輕骨質(zhì)疏松大鼠病理癥狀，并且提高骨礦含量和力學(xué)性能。Yang等[20]將女貞子和淫羊藿兩種藥材以3 ∶4的比例混合，對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠給藥8周，與對照組相比，復(fù)方藥物能明顯增加血清骨源性堿性磷酸酶(B-ALP)、血清骨γ羧基谷氨酸蛋白、血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2等骨代謝標(biāo)志物，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶和I型膠原羧基末端肽交聯(lián)含量，抑制骨吸收和增加骨密度，改善骨的力學(xué)特性。

含淫羊藿(E)、女貞子(L)和補骨脂(P)三味藥的傳統(tǒng)復(fù)方制劑ELP已被證明能明顯抑制老年去勢♀骨質(zhì)疏松大鼠脊柱BMD丟失。對3月齡SD大鼠進行尾懸吊法建立廢用性骨質(zhì)疏松模型，將女貞子、淫羊藿以及補骨脂按照生藥材重量比4 ∶5 ∶1的比例混合、浸泡、蒸餾，制成復(fù)方水提物，發(fā)現(xiàn)復(fù)方ELP可以明顯抑制大鼠后肢的BMD流失[21]。進一步實驗研究發(fā)現(xiàn)，ELP提取物明顯上調(diào)MSCs的ALP基因表達，可以促進成骨細胞活性。另有研究將復(fù)方ELP的3種單味藥進行排列組合，將復(fù)方ELP與其他組合比較，以考證復(fù)方ELP抗骨質(zhì)疏松作用。從各組合不同藥物代謝動力學(xué)參數(shù)可以明顯發(fā)現(xiàn)，ELP組合更加有效，在抗骨質(zhì)疏松方面3種草藥出現(xiàn)協(xié)同增效作用。

3 女貞子活性成分抗骨質(zhì)疏松作用研究

女貞子化學(xué)成分包括三萜類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類等化合物，根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺收錄，女貞子中所含化合物超過200種之多，其中女貞子主要活性成分是齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷、苷元酪醇等。

3.1齊墩果酸(oleanolicacid,OA) OA屬于五環(huán)三萜類化合物，常以游離體和配糖體存在于女貞子等多種植物中。OA具有多種生物學(xué)作用，如抗病毒、消炎、抗氧化等，且細胞毒性較低。隨著對OA的不斷深入研究，目前已經(jīng)證明，OA在動物實驗中提高去卵巢和更年期大鼠體內(nèi)雌二醇水平；提高絕經(jīng)期婦女的外周血清雌激素受體表達水平。3月齡小鼠去卵巢造模1周后，經(jīng)OA治療3個月，發(fā)現(xiàn)OA能夠明顯抑制OVX小鼠破骨細胞活性，增強骨密度。Shu等[22]進一步揭示了OA對MSCs向成骨細胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)OA在誘導(dǎo)MSCs分化過程中，ALP染色明顯增強，且存在劑量依賴性，表明OA可誘導(dǎo)體外骨髓基質(zhì)干細胞成骨。為了尋找可能參與這一過程的調(diào)控分子，通過RT-PCR定量鑒定了幾種成骨標(biāo)記物基因。相比于對照組，早期成骨細胞標(biāo)記物I型膠原(COL1A1)、ALP、轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達增加，而晚期成骨標(biāo)記物OC和OPN保持不變，這表明OA主要在MSCs成骨分化的起始階段起作用。

3.2紅景天苷(salidroside,SAL) SAL屬于酚苷類化合物，可以從天然植物中提取，也可以人工合成，主要藥理作用包括抗腫瘤、保護心肌缺血損傷、保肝護腎等。SAL體內(nèi)、外具有較好的抗氧化應(yīng)激作用。低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)在骨生成和骨的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。有研究報道[23]，小鼠源成骨細胞MC3T3-E1經(jīng)H2O2刺激后，相較于模型組，SAL能明顯提高細胞存活率，提高ALP活性、鈣沉積，降低細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，上調(diào)ALP、COL1A1、OC的轉(zhuǎn)錄水平，并下調(diào)誘導(dǎo)破骨細胞分化的細胞因子如RANKL、IL-6表達，通過降低骨吸收因子和減少氧化損傷來達到防治骨質(zhì)疏松作用。Li等[24]以人成骨樣細胞MG-63和新生大鼠顱骨成骨細胞(rat osteoblastic cell，ROB)為研究模型，體內(nèi)以O(shè)VX大鼠為模型，研究細胞中常氧和低氧狀態(tài)下，SAL對HIF-1信號通路的調(diào)控作用。結(jié)果表明，SAL預(yù)處理能明顯減輕細胞缺氧所導(dǎo)致的活力下降、凋亡，下調(diào)HIF-1的表達，但是HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性增加，從而上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，SAL改善了OVX大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)，增加股骨遠端骨密度。

4 小結(jié)

一系列基礎(chǔ)研究與臨床研究結(jié)果顯示，女貞子及其復(fù)方都具有較好的抗骨質(zhì)疏松作用[25]。已有的藥理研究揭示女貞子可通過多種作用途徑發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，這為女貞子的藥物開發(fā)與綜合利用，尤其是抗骨質(zhì)疏松中藥研發(fā)提供了堅實的實驗基礎(chǔ)。女貞子所含的某些活性成分也顯示具有抗骨質(zhì)疏松作用，對其藥理作用機制還有待深入研究，尤其是哪些活性成分具有調(diào)控維生素D代謝、CaSR-PTH軸等的生物學(xué)作用，需要后續(xù)進一步探索。