表觀遺傳學(xué)在肺動脈高壓發(fā)病機制和治療中的研究進展

張春芳，徐雙蘭，趙方允，邢西遷，楊 姣

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院 1. 呼吸內(nèi)一科、2. 藥學(xué)部，云南 昆明 650051；3. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，云南 昆明 650032)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension, PH)是指肺動脈壓力超過一定界值的一種血流動力學(xué)異常狀態(tài)，導(dǎo)致右心負荷增大和右心功能不全，從而引起一系列臨床表現(xiàn)。PH的病理生理特點為肺動脈壓力的升高及肺血管阻力的增加，通常導(dǎo)致右心衰竭和死亡。表觀遺傳學(xué)是研究在DNA序列沒有改變的情況下，基因功能可逆的、可遺傳改變的一門生物學(xué)學(xué)科[1]。大量研究表明，表觀遺傳學(xué)修飾異常在人類復(fù)雜性疾病如惡性腫瘤、神經(jīng)精神疾病、心血管疾病等的發(fā)病機制中起重要的作用[2-4]。近年來，表觀遺傳學(xué)在PH方面的研究逐漸增多，其在該病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用越來越被人們所認識。表觀遺傳學(xué)機制是基因和環(huán)境相互作用產(chǎn)生的，研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)和顆粒容素基因位點的DNA甲基化狀態(tài)、組蛋白H1水平、組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDACs)、microRNA的失調(diào)，這些因素相互作用形成表觀遺傳修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與PH的表觀遺傳學(xué)機制[5-6]。一些環(huán)境因素可能通過目前尚未發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳學(xué)機制，導(dǎo)致PH的發(fā)生[1]。然而，有許多至今未闡明的PH的表觀遺傳成分。本文主要對DNA甲基化和組蛋白修飾在PH發(fā)生、發(fā)展中的作用，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑、HDACs抑制劑及其他潛在治療靶點對PH的治療作用及機制進行綜述。

1 表觀遺傳學(xué)的基礎(chǔ)理論

DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA是目前研究最廣泛和最深入的表觀遺傳分子機制。表觀遺傳在環(huán)境的影響下參與基因表達調(diào)控。

1.1DNA甲基化DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化發(fā)生，并維持與調(diào)控。在哺乳動物細胞中，胞嘧啶特異性甲基轉(zhuǎn)移酶使CpG二核苷酸序列發(fā)生甲基化，從而調(diào)節(jié)基因表達和細胞分化[7]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用主要是抑制DNA轉(zhuǎn)錄。CpG島發(fā)生甲基化會引起抑癌基因的沉默，原癌基因的低甲基化會引起該基因的過表達，這兩方面會導(dǎo)致腫瘤的形成[2]?？傊珼NA甲基轉(zhuǎn)移酶對于DNA甲基化模式的調(diào)控至關(guān)重要，它們在機體發(fā)育以及疾病的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮重要作用。

1.2組蛋白修飾在常規(guī)的核小體中，共有4種組蛋白，H3、H4、H2A、H2B。每種組蛋白的2個拷貝結(jié)合在一起，形成了一個組蛋白八聚體；約146 bp的DNA片段按照左手螺旋的方式在這個八聚體外纏繞約1.8圈，就構(gòu)成了1個核小體的核心顆粒。核小體通過控制DNA和組蛋白的結(jié)合性和轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)基因表達[7]。組蛋白的翻譯后修飾是表觀遺傳調(diào)控的核心手段。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少8種不同的修飾類型，其中最為常見的4種修飾，即乙?；?、甲基化、磷酸化和泛素化，且都是可逆的[7]。乙?；亲畛Ｒ姷谋碛^遺傳修飾。組蛋白乙?；揎棸l(fā)生在賴氨酸殘基，修飾的位點主要分布在H3和H4的N端尾部，組蛋白乙酰化水平升高與轉(zhuǎn)錄活性增加相關(guān)[1]。組蛋白乙?；腿ヒ阴；且粋€動態(tài)過程。翻譯后的廣泛組蛋白修飾的組合構(gòu)成“組蛋白代碼”，是調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要手段[1]。

1.3非編碼RNA與基因表達調(diào)控非編碼RNA主要包括4類。第1類是管家基因的轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、核小RNA；第2類是小干擾RNA、與PIWI蛋白相互作用的RNA,它們是非編碼RNA中重要的一部分；第3類是microRNA,它起到一種微調(diào)的作用；第4類是長鏈非編碼RNA,它在基因調(diào)控中不僅能激活基因，還抑制基因。

2 表觀遺傳學(xué)成分在PH發(fā)生、發(fā)展中的機制

2.1DNA甲基化與PH

2.1.1SOD2 SOD2位于線粒體中，是內(nèi)生的過氧化氫產(chǎn)生的主要來源。在生理層面上，過氧化氫是擴張血管、抗細胞增殖、氧化還原反應(yīng)的信號分子[8]。SOD2是腫瘤抑制基因的候補者，在很多惡性腫瘤中是沉默狀態(tài)，如多發(fā)性骨髓瘤和胰腺癌中，SOD2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化導(dǎo)致該基因沉默[1]。腫瘤細胞中SOD2基因的去甲基化會恢復(fù)SOD2的活性，增加過氧化氫的生成，抑制腫瘤細胞的增殖，SOD2的甲基化也同樣出現(xiàn)在PH患者中[8]。

過量的活性氧和還原型輔酶Ⅱ氧化酶類的表達增加，在促成PH方面有重要作用，還原型輔酶Ⅱ氧化酶類是活性氧的主要來源[9]。正常情況下活性氧不斷地產(chǎn)生，同時也不斷地被SOD2等清除，保持一種平衡狀態(tài)。SOD2基因的甲基化，一方面降低了過氧化氫的產(chǎn)生，另一方面減少了對活性氧的清除?；蚪M測序表明，SOD2基因CpG島的甲基化選擇性地發(fā)生在肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)，而不在主動脈平滑肌細胞。據(jù)研究，在PH患者或動物模型的叢狀病變中分離出的PASMCs中，SOD2出現(xiàn)甲基化，使SOD2表達降低，減少過氧化氫的生成,激活低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α) 的活性，導(dǎo)致凋亡蛋白酶被抑制，增加細胞增殖/凋亡率，促成患有PH的患者和Fawn-hooled鼠的血管阻塞，肺動脈壓力升高[1, 8, 10]。

2.1.2顆粒溶素 最近從人類的外周血單核細胞和移植肺中提取的基因組DNA分析結(jié)果顯示，患有肺靜脈閉塞病的顆粒溶素基因的甲基化程度要比PH患者高，具體的分子機制還有待進一步研究。顆粒溶素基因可能為PH治療提供創(chuàng)新性的治療靶點[11-12]。

2.1.3胰島素樣生長因子-1 胰島素樣生長因子-1信號的表觀遺傳調(diào)控包括DNA甲基化、組蛋白乙?；揎?，在新生兒PH發(fā)病機制中起重要作用。胰島素樣生長因子-1信號分子的異常，導(dǎo)致肺動脈血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞功能紊亂，進而導(dǎo)致血栓形成、細胞異常增殖。進一步深入研究胰島素樣生長因子-1信號通路的表觀遺傳學(xué)改變，可能為新生兒PH的治療帶來新思路[13]。

2.1.4ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1 最近研究表明，PH患者的肺內(nèi)皮細胞中，涉及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑基因ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1的甲基化，使ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1的mRNA和蛋白表達下調(diào)，導(dǎo)致肺內(nèi)皮細胞功能障礙，這可能與PH的病理生理有關(guān)[14]。

2.2組蛋白修飾與PH

2.2.1內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 有研究表明，eNOS的超乙?；c新生兒持續(xù)性PH的形成有關(guān)[15]。研究者通過給孕期大鼠吲哚美辛和宮內(nèi)缺氧來誘導(dǎo)新生鼠持續(xù)性PH模型，發(fā)現(xiàn)在這種大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞中eNOS的表達量明顯增加，是eNOS的啟動子乙酰化所致。在此模型中，eNOS的表達上調(diào)與eNOS啟動子區(qū)域的H3和H4組蛋白乙?；纳哂嘘P(guān)，而且eNOS甲基化輕度降低[1]。導(dǎo)致eNOS超乙?；脑蚣霸谥委烶H時怎樣去避免eNOS超乙?；?，有待進一步研究。

2.2.2肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2) MEF2是轉(zhuǎn)錄因子的一個家族，它在細胞分化與胚胎發(fā)育方面有重要作用。MEF2家族主要有4個成員：MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。其中，MEF2A和MEF2C在內(nèi)皮細胞中高表達。內(nèi)皮細胞特異性MEF2C缺乏小鼠視網(wǎng)膜血管的損傷減少，內(nèi)皮細胞的凋亡降低，這表明MEF2在血管內(nèi)是一個重要的內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄因子[16]。最近研究表明，MEF2不僅在內(nèi)皮中具有重要作用，而且在維持肺血管的動態(tài)平衡中也有效。MEF2的活性受損，導(dǎo)致肺動脈血管動態(tài)平衡的靶基因下調(diào)，包括miRNA-424和miRNA-503等， 進而導(dǎo)致PH的病理學(xué)變化[17]。

2.2.3內(nèi)皮素-1 內(nèi)皮素-1是一種強烈的血管收縮活性物質(zhì)，可引起血管收縮和細胞增生。研究發(fā)現(xiàn)，新發(fā)生的低氧性PH的患者血清中內(nèi)皮素-1、HIF-1α水平與肺動脈收縮壓呈正相關(guān)[18]。缺氧導(dǎo)致的胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠，在以后的生活中可引起不同程度的PH和肺血管重塑。研究證實，胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩很可能與組蛋白乙?；胶虷IF-1α在內(nèi)皮素-1基因核心的啟動子區(qū)域結(jié)合水平升高有關(guān)。這些表觀遺傳變化可能導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠在以后的生活中對缺氧高度敏感[19]。持續(xù)低氧導(dǎo)致肺動脈內(nèi)皮細胞的損傷，內(nèi)皮細胞所釋放的一氧化氮、內(nèi)皮素、前列環(huán)素等活性物質(zhì)發(fā)生異常，從而引起肺血管異常收縮，導(dǎo)致更嚴重的PH或肺血管重構(gòu)[20]。結(jié)果表明，表觀遺傳學(xué)與繼胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩之后的缺氧性PH的發(fā)展有關(guān)，為進一步提高胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩相關(guān)的PH的預(yù)防和治療提供了一種新方向。

2.2.4線粒體去乙?；? 最近發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性PH患者的PASMCs中，局限性的線粒體去乙?；?的表達降低。敲除線粒體去乙酰化酶3的小鼠，線粒體去乙酰化酶3的表達量降低能夠抑制線粒體的功能，抑制細胞凋亡，激活數(shù)個與PH相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如HIF-1α、信號轉(zhuǎn)換器、活化T細胞的細胞核因子[11]。

2.2.5超氧化物歧化酶3(extracellular superoxide dismutase，EC-SOD或SOD3) SOD3是一種胞外的超氧化物歧化酶，能夠快速地把超氧化物分解成過氧化氫。SOD3是脈管系統(tǒng)中最豐富的一種超氧化物歧化酶，占所有SOD活性中的60%～70%。在PH或者其他心血管疾病的動物模型中，缺失SOD3會增加疾病的嚴重程度。研究表明，血管抗氧化酶SOD3，而不是SOD2的表達量在特發(fā)性PH中選擇性減少，其活性也降低。在眾多腫瘤的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)DNA的超甲基化可以降低SOD3的表達量。現(xiàn)已證實，Ⅰ類HDAC3可以降低SOD3的表達，增強特發(fā)性PH PASMCs的增殖。SOD3對不同類型的PH患者的細胞特異性調(diào)控機制，確定選擇性HDACs抑制劑是否可以提高SOD3的活性，還需進一步研究[21]。

3 表觀遺傳學(xué)與PH治療

3.1DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2′脫氧胞苷(5-aza-2′deoxycytidine，5-Aza-CdR)逆轉(zhuǎn)SOD2基因的甲基化狀態(tài)，不僅可以恢復(fù)SOD2的表達，提高細胞凋亡率，還可以降低患有PH的Fawn-hooled鼠PASMCs異常增殖；同樣，過表達PASMCs的SOD2基因或者通過提供SOD類似物(MnTBAP)可以逆轉(zhuǎn)PH Fawn-hooled大鼠PASMCs的過度增殖[10]。SOD2補充給藥和5-Aza-CdR在細胞實驗中都有效，表明這兩種方法在治療SOD2甲基化方面有較大作用，但是，目前SOD2表達量減少導(dǎo)致的PH發(fā)生、發(fā)展最主要的治療方法還是SOD2類似物MnTBAP。經(jīng)證實，MnTBAP能夠逆轉(zhuǎn)活體PH的形成，并降低肺毛細血管前阻力血管的肌化[8,10]。

3.2HDACs抑制劑HDACs基因的表達通過乙酰化修飾控制PH，HDACs去除組蛋白上賴氨酸尾巴上的乙酰基團。通常去乙?；瘯?dǎo)致染色質(zhì)濃縮，降低基因轉(zhuǎn)錄。HDACs抑制劑如丙戊酸，是HDAC I類抑制劑，用于治療癲癇和抗腫瘤；肟異羥肟酸是一個廣譜HDACs抑制劑，批準(zhǔn)用于 T細胞淋巴瘤的治療。以上兩種藥物在治療PH模型方面有效[11]。I類HDACs抑制劑通過拮抗血小板源性生長因子對PASMCs的作用，抑制PASMCs的增殖和遷移，表明組蛋白去乙?；概cPASMCs的過度增生有關(guān)，抑制去乙酰化會產(chǎn)生細胞凋亡的效應(yīng)[22]。HDACs抑制劑可以通過抗血管生成、促進細胞凋亡，實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)右心室的功能，HDACs抑制劑也降低了心肌的纖維化[22-23]。還有研究表明，另一種HDACs抑制劑曲古抑菌素A通過增加特發(fā)性PH PASMCs中SOD3的表達，部分逆轉(zhuǎn)特發(fā)性PH[21]。然而，并不是所有的研究結(jié)果都得出HDACs抑制劑有利于右心室肥厚的逆轉(zhuǎn)。有研究報道，曲古抑菌素A處理的大鼠出現(xiàn)心輸出量減少和右心衰竭的跡象，這種結(jié)果和之前研究的HDACs對右心室肥厚和左心室肥厚有益相反。這表明可能有多種HDACs抑制劑，需要進一步研究一個特定的HDACs家族中是否有一特定的抑制劑亞型對右心室肥厚有益或有害[1, 23-24]。

4 結(jié)語

近年來，表觀遺傳學(xué)在PH方面研究發(fā)展迅猛，至今已發(fā)現(xiàn)很多可能與PH的發(fā)生、發(fā)展機制相關(guān)的表觀遺傳學(xué)成分，并對DNA甲基化和組蛋白乙?；M行了藥物干預(yù)。文獻報道，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和HDACs抑制劑在治療多種腫瘤方面可能有效[25]，但對于治療PH的動物實驗效果并不確切，有些還存在嚴重副作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的突飛猛進，希望今后的研究中，對于已經(jīng)確定的甲基化藥物干預(yù)和組蛋白去乙?；幬锔深A(yù)進行更精確的靶向治療；通過基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的高通量技術(shù)，進一步研究導(dǎo)致PH發(fā)生、發(fā)展的機制，發(fā)現(xiàn)新的表觀修飾作用的靶點，并對其進行靶向藥物或技術(shù)干預(yù)。雖然此過程可能不是一帆風(fēng)順，但可以肯定的是，表觀遺傳修飾藥物或技術(shù)干預(yù)具有廣闊的應(yīng)用前景。