單克隆抗體純化方法比較論述

馬 莉 劉 雙，2

（1.新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊縣畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 830036；2.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830000）

單克隆抗體制備的理論基礎是F. Macfarlane Burnet的克隆選擇學說（1959）：每個哺乳動物B淋巴細胞有特異性抗體的潛力?？贵w鏈的恒定區(qū)域可能會改變在淋巴細胞克隆的分化過程中，但可變區(qū)保留這種奇異的特異性。1975年Kohler和Milstein開發(fā)出一種能提高抗原表位的特異性抗體技術；這種技術被命名為雜交瘤技術，用這種方法生產的抗體稱為單克隆抗體。隨著單克隆抗體的廣泛應用，其純化技術也在快速發(fā)展。本文將介紹幾種試用于中小規(guī)模的抗體純化方法，通過比較來選擇適合的方法。

1 抗體純化

1.1 沉淀法

沉淀法是利用不同蛋白質疏水性的不同，提高鹽濃度，可是蛋白質的疏水性增加，使其沉淀而分離。將30%～50%飽和硫酸銨（AS）加入到血清或者腹水中來沉淀抗體中的免疫球蛋白，通過離心分離沉淀與未沉淀的蛋白質。當重懸沉淀后，獲得的上清溶液即為富含抗體的液體。沉淀法的操作非常容易，成本廉價，適用于所有血清和腹水。但同時也存在不足，抗體的提純效果不高，而且不適用于單克隆細胞培養(yǎng)上清的提純，有一定的局限性。

1.2 離子交換層析法

離子交換層析法（Ion exchange chromatography，IEC）使用最大的一個限制就是需要知道抗體的等電點（Isoelectric point，pI），很明顯，單克隆抗體的pI范圍較窄。所用的陰陽離子交換樹脂作用于單克隆抗體的效果要好于多克隆抗體。IEC最大的優(yōu)點是它能分離除去單克隆抗體中的蛋白質A/G、DNA、逆轉錄病毒及內毒素，所得的單克隆抗體純度可被認為＞90%，并且適合大多數的抗體及亞型，這對于制備用于動物實驗和臨床試驗的單克隆抗體具備很大價值。但對于其他的抗體純化效果就變異性很大，純化范圍在60%～95%。

1.3 分子篩層析法

分子篩層析法（Size exclusion chromatography，SEC）是一種較溫和的純化方法，它可用生理條件下的緩沖液將抗體在最適pH中進行純化。生產所用的樹脂主要是在顆粒的孔徑度的數值上有所不同。待純化樣品中的大分子不進入膠孔內而先流出，過柱速度快于小分子；小分子流經孔徑時被阻止而進入基質，所以后洗脫。生產所使用的柱子均較小，一次只能純化幾毫克的量，但使用SEC仍是增加抗體產品純度較有效的方法。

1.4 蛋白質A和蛋白質G

蛋白質A和蛋白質G均是細菌細胞壁的一個結構組成，對免疫球蛋白的Fc區(qū)域有高度結合親和性。蛋白質A依據這種特性能夠根據亞型來純化單克隆抗體。例如，小鼠的腹水含有自身免疫球蛋白（一般為IgG1和IgM）和雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。蛋白質A在低鹽條件下不結合IgM，與IgG1有微弱結合，因此，如果單克隆抗體的亞型是IgG2a、IgG2b或IgG3，那么便可獲得相對純凈的單克隆抗體。在高鹽（3 mol/L）結合緩沖液的條件下，蛋白質A可成功用于純化IgG1，那么用小鼠為容器所制的單克隆抗體無法清除這些自身免疫球蛋白。

蛋白質A/G是最好的抗體第一步純化方法，可進行大樣本純化，但經濟成本也相對要高得多?？紤]到各個實驗室實際情況，可將蛋白質A/G凝膠柱重復使用，但要注意若要用于不同抗體的純化，柱子需再生。

2 結語

抗體的最終用途將決定其被純化的方法。對于快捷廉價的純化，沉淀法足矣。但如果用于診斷，蛋白質A/G純化的抗體能提供好的檢測結果的重復性。如果用于臨床前期研究，蛋白質A/G純化的抗體再用IES、SES或疏水作用色譜法進一步純化將得到高純度抗體。對于任何臨床前期和臨床應用，抗體純化必須在無菌和低內毒素的條件下進行，必須符合當地的法定操作程序。因此對于每個實驗室，每種抗體應該確定一種純化策略，為抗體的生產提供更好更優(yōu)的條件。