近紅外熒光(NIRF)染料在腫瘤診斷中的應(yīng)用

趙 勇，王 浩，師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，西安 710032)

光學(xué)成像作為非侵入性、實(shí)時(shí)和高分辨率的腫瘤診斷方式，對腫瘤的早期診斷具有重要的意義。光信號可以提供生物組織的分子信息，與腫瘤解剖結(jié)構(gòu)以及腫瘤代謝和生物化學(xué)關(guān)系密切。在光學(xué)成像中，近紅外熒光(near-infrared fluorescence，NIRF)由于其波長在700～1000 nm范圍內(nèi)，生物組織對該范圍波長的吸收較低、自發(fā)熒光較少，因此可以最大限度地減少背景干擾，增強(qiáng)組織的穿透深度和圖像的靈敏性[1]。為了提高腫瘤的靶向性以及近紅外熒光對腫瘤和背景信號的比值(T/B值)，研究者們通過對常規(guī)NIRF染料的結(jié)構(gòu)修飾、偶聯(lián)腫瘤的靶向配體、納米修飾以及采用多模態(tài)成像方式等策略，研發(fā)了一批具有腫瘤診斷優(yōu)勢的NIRF探針。本文主要就NIRF染料在腫瘤診斷研究方面的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NIRF染料直接應(yīng)用于腫瘤成像

NIRF探針包括了無機(jī)和有機(jī)分子。無機(jī)NIR染料主要與光量子點(diǎn)[2-3]和納米粒子的修飾相關(guān)[4]。但這些納米顆粒的重金屬成分(如鎘、硒)或其表面涂覆材料(例如十六烷基三甲基溴化胺，CTAB)存在潛在細(xì)胞毒性[5]，使其無法進(jìn)行大規(guī)模開發(fā)和應(yīng)用[6]。與無機(jī)探針相比，有機(jī)NIR熒光染料在腫瘤成像中具有極大的應(yīng)用潛能，人們通過改進(jìn)NIRF探針的光物理性質(zhì)，可進(jìn)行大量化學(xué)合成[7]。這些有機(jī)NIRF染料還表現(xiàn)出與各種特異性分子結(jié)合的能力，如化學(xué)小分子、氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、DNA引物、雙鏈DNA和抗體等[8]。它們通過共價(jià)或非共價(jià)的方式與腫瘤靶向組織進(jìn)行結(jié)合，提高腫瘤檢測的特異性和敏感性。

有機(jī)NIRF染料雖然得到廣泛而持續(xù)的關(guān)注，但大部分NIRF染料依然表現(xiàn)出親水性差、光穩(wěn)定性差、量子產(chǎn)率低、穩(wěn)定性不好、在生物體系中檢測靈敏度較低等問題，極大地限制了使用。目前較為成熟的NIRF染料包括花菁類染料、方酸菁、酞菁、卟啉衍生物和BODIPY(硼二吡咯甲烷)類似物等，具有一定的化學(xué)和光穩(wěn)定性、較高的熒光強(qiáng)度和較長熒光壽命。一些染料的水溶性也得到了改善，避免在機(jī)體和組織中的聚集。其中，花菁素類和卟啉衍生物的應(yīng)用最為普遍。

花菁素類染料是通過聚甲基橋連接的兩個(gè)芳香族含氮雜環(huán)的一類共軛有機(jī)小分子體系，通過增加1, 2-亞乙烯基單元延長共振聚甲川鏈可以使吸收波長發(fā)生紅移，研究表明每增加一個(gè)1, 2-亞乙烯基單元可使吸收光紅移100 nm[9]?；ㄝ妓仡惾玖夏苤鲃有罘e在腫瘤組織，發(fā)揮腫瘤靶向作用，具有較高的T/B值。該類化合物還具有較好的光學(xué)性質(zhì)，如IR-780[10]、IR-783[11]、IR-808[12]和MHI-148[13]等。IR-780具有較高的T/B值，但其強(qiáng)疏水性影響了溶解度[14]；IR-783作為IR-780的衍生物[15]，可以選擇性地在腫瘤部位蓄積，可用于原位或轉(zhuǎn)移瘤的檢測；類似還有IR-808也可在腫瘤組織主動蓄積，水溶性更好，毒性也較低[16]。另外一類常見的NIRF染料為卟啉衍生物，如四氮雜卟啉247(Pz-247)的熒光發(fā)射波長超過700 nm，可與低密度脂蛋白的疏水核心結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的胞吞，特異性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞[17]。但對于臨床應(yīng)用來說，腫瘤靶向NIRF染料的整體表現(xiàn)尚不理想，例如溶解性差，存在系統(tǒng)性毒性等問題亟待解決。此外，一些具有疏水性的NIRF染料會蓄積到機(jī)體的正常器官，如肺和睪丸。因此，研發(fā)水溶性好、毒性低和腫瘤特異性好的NIRF染料將是腫瘤非侵入性診斷的方向。

2 偶聯(lián)腫瘤靶向配體的NIRF染料用于腫瘤成像

顯像試劑的腫瘤靶向性對于腫瘤檢測的特異性和敏感性至關(guān)重要。然而，大部分的NIRF探針并不具備或僅有極低的靶向能力，這就限制了NIRF染料在腫瘤顯像中的應(yīng)用。通常NIRF染料需要與腫瘤特異性配體的結(jié)合實(shí)現(xiàn)對腫瘤的主動靶向性。這些特異性配體包括化學(xué)分子、肽、蛋白質(zhì)，抗體，核酸適配體等，能夠特異性地識別腫瘤細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)記物。

目前，用于體內(nèi)NIRF腫瘤成像最常見的NIR染料包括cy5、cy5.5、cy7。這些染料和腫瘤特異性的配體進(jìn)行偶聯(lián)識別腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行特異性成像，增加成像T/B值。結(jié)合的配體包括代謝底物[18]、細(xì)胞表面肽[19]、生長因子[20]、抗體[21]和腫瘤細(xì)胞表面特異性生物標(biāo)志物[22]等。例如cy7與前列腺癌特異性分子標(biāo)志物——前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)分子靶點(diǎn)結(jié)合形成cy7-CTT54.2偶聯(lián)物[23]；cy7、cy5.5分別與卵巢癌、胃癌αvβ3整合蛋白的cRGD(Arg-Gly-Asp)肽段結(jié)合[24]；cy5.5與肺癌新生血管的內(nèi)皮抑制因子結(jié)合等。然而，這種通過NIRF染料與腫瘤靶向配體偶聯(lián)的策略依然存在一定的問題，主要體現(xiàn)在這種化學(xué)共軛的過程可能會破壞一些NIR染料或腫瘤靶向配體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致成像或靶向性的損耗或喪失。此外，一些化合物還可能顯示出差的光學(xué)穩(wěn)定性或其它一些缺陷，限制了腫瘤成像的廣泛應(yīng)用。因此如何保持染料和腫瘤靶向配體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及靶向配體的親和力也是未來研究的重點(diǎn)。

3 納米修飾NIRF探針用于腫瘤成像

隨著納米材料的發(fā)展，為增強(qiáng)腫瘤分子成像的靈敏性和特異性提供了新的途徑。基于納米材料的NIRF分子探針可以通過增強(qiáng)腫瘤微血管系統(tǒng)的通透和滯留作用，或通過與腫瘤相關(guān)配體的特異性結(jié)合靶向到腫瘤，這些配體包括腫瘤細(xì)胞受體、腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)或酶等。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，基于納米材料包裹的NIRF染料越來越多，它們克服了游離染料的局限性，有機(jī)NIRF染料的納米包裝可以使得它們產(chǎn)生比未包裝的初級狀態(tài)具有更強(qiáng)的熒光信號和更好的光穩(wěn)定性。一些NIRF染料還通過對納米材料表面的改構(gòu)，改善NIRF染料的親水性以減少聚集。此外，納米顆粒提供了較大的表面積以延長NIRF染料多次成像的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。目前，大量研究集中于納米粒子傳遞以及成像和治療性藥物的整合，已經(jīng)開發(fā)了如二氧化硅、脂質(zhì)體、低密度脂蛋白或聚合物體(例如殼聚糖聚合物、聚乙烯亞胺和磷酸鈣等)制備的各種NIRF染料包封的納米顆粒[25]，并進(jìn)行了腫瘤的成像或治療。例如利用二氧化硅顆粒包裹的NIRF染料成功應(yīng)用于小鼠前哨淋巴結(jié)的標(biāo)記和腫瘤的標(biāo)記[26]；而超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)納米顆粒包裹吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)和RGD也表現(xiàn)出良好的雙模態(tài)腫瘤特異性成像[27]；將ICG包載入30～120 nm的納米顆粒中，可以延緩代謝時(shí)間，提高攝取量[28-29]。靶向或非靶向的納米載體均可使包裹的ICG隨納米顆粒一同被腫瘤細(xì)胞所攝取并滯留在瘤體內(nèi)。文獻(xiàn)報(bào)道NIRF染料可被納米顆?；蚓酆衔锇揎?，通過特異性受體介導(dǎo)的靶向藥物遞送途徑或增強(qiáng)腫瘤微血管系統(tǒng)的滲透性增強(qiáng)與滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)等途徑實(shí)現(xiàn)對腫瘤的主動靶向性[30]。

雖然這些納米顆粒是用于腫瘤特異性成像的較好方式，但它們?nèi)蕴幱谂R床應(yīng)用的早期階段?？偟膩砜?，納米顆粒修飾的NIRF染料無毒性、具有良好的生物相容性；同時(shí)，利用腫瘤微環(huán)境的滲透性增強(qiáng)與滯留效應(yīng)，使得納米粒等膠粒給藥系統(tǒng)被動靶向富集于腫瘤，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的被動靶向[5]。但是，目前納米NIRF染料的應(yīng)用僅限于細(xì)胞水平和實(shí)驗(yàn)動物，其潛在的系統(tǒng)性毒性，以及凍干后的穩(wěn)定性限制了其廣泛應(yīng)用[31]。因此，開發(fā)具有可生物降解或表面包裹的納米顆粒材料，如磷酸鈣、低密度脂蛋白和聚合物等納米粒子的NIRF納米探針將成為未來研究的方向。

4 NIRF染料在術(shù)中導(dǎo)航中的應(yīng)用

外科手術(shù)是腫瘤重要治療方法，但在手術(shù)過程中，如何動態(tài)監(jiān)測前哨淋巴結(jié)、判定腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的范圍以及腫瘤切緣是否安全等都是外科醫(yī)生面臨的挑戰(zhàn)。NIRF染料的應(yīng)用研究為解決上述問題提供了有效的方法和手段。NIRF由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，使外科手術(shù)更快捷、精準(zhǔn)、安全，避免過多切除腫瘤周圍正常組織，提高切除的精準(zhǔn)度，降低復(fù)發(fā)概率，減少并發(fā)癥。2009年Ishizawa等最先將ICG應(yīng)用于肝臟外科的術(shù)中導(dǎo)航并取得較好的效果[32]。隨后在腎臟腫瘤、乳腺癌前哨淋巴結(jié)、惡性黑色素瘤以及胃腸腫瘤等檢測中都有一定的應(yīng)用[33]。在肝臟外科中，ICG不僅可以對肝功能進(jìn)行評價(jià)，還能指導(dǎo)肝腫瘤切除[34]以及肝臟移植供體切除[35]等方案的制定。隨著ICG在肝臟外科的應(yīng)用拓展，還能使膽道[32]和肝細(xì)胞癌[36-37]組織可視化。術(shù)前注射ICG，在術(shù)中通過近紅外光源激發(fā)可使得腫瘤在肝臟表面相應(yīng)透射區(qū)呈現(xiàn)熒光。一般情況下不同分化程度的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)存在一定的差異[36-37]，表現(xiàn)在高分化的HCC呈現(xiàn)均勻而高強(qiáng)度的熒光，中等分化的HCC呈現(xiàn)部分而不均勻的熒光顯像，而低分化的HCC以及結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移病灶則不顯示熒光，而是在腫瘤周圍的肝組織呈現(xiàn)環(huán)狀熒光顯像。術(shù)中腫瘤的熒光成像能提高微小腫瘤的確診率，尤其是臨床檢查和術(shù)前影像不能確定時(shí)，術(shù)中熒光成像表現(xiàn)出絕對的優(yōu)勢。如果再結(jié)合肝臟視診、觸診及術(shù)中超聲檢測進(jìn)行比較和聯(lián)合應(yīng)用，能準(zhǔn)確判定腫瘤的大小和位置。此外，熒光顯像技術(shù)能夠?qū)η谐龢?biāo)本微小轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行多層面檢測，防止術(shù)中陽性切緣的出現(xiàn)。

5 基于NIRF染料的多模態(tài)成像

理想的分子影像技術(shù)應(yīng)該盡可能同時(shí)提供生物過程的解剖結(jié)構(gòu)水平、功能代謝水平、生理病理水平和分子細(xì)胞水平等信息，但目前尚無一種成像技術(shù)能夠同時(shí)具備上述功能。鑒于CT、PET-CT、MRI等在腫瘤診斷中的靈敏性，再結(jié)合近紅外光學(xué)成像的特性，可對NIRF染料分子成像的缺陷進(jìn)行有效補(bǔ)充[38]。因此，開發(fā)基于NIRF的多模態(tài)融合分子影像技術(shù)具有重要意義。由于NIRF用于生物成像的空間分辨率較低，但MRI和PET能提供較高的分辨率，NIRF與MRI或PET可以彌補(bǔ)這種缺陷。此外，利用MRI對軟組織具有高對比度和空間分辨率優(yōu)勢，以及NIRF在術(shù)中導(dǎo)航的靈敏度和實(shí)時(shí)性的優(yōu)勢，開發(fā)的MRI-NIRF雙模態(tài)分子探針能結(jié)合兩種成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，對肝癌顯示出較好的成像效果，同時(shí)滿足了術(shù)前規(guī)劃和術(shù)中導(dǎo)航的需求[27]，這種策略使得外科醫(yī)生在術(shù)前能更好地了解腫瘤的數(shù)量、位置和大小，并使用NIRF術(shù)中導(dǎo)航技術(shù)的特性，精準(zhǔn)地對腫瘤進(jìn)行切除。Sampath等利用PET/近紅外試劑用于對晚期乳腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)行分析，并利用術(shù)中導(dǎo)航特性對腫瘤進(jìn)行精準(zhǔn)切除[39]；南方醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)的SPIO@Liposome-ICG-RGD多功能納米探針，就是利用RGD與αvβ3受體的結(jié)合能力以及超順磁性氧化鐵的低毒性、高靈敏性以及很好的組織相容性特點(diǎn)，在注射72 h后，通過MRI和NIRF獲得良好的成像效果，給術(shù)前診斷和術(shù)中導(dǎo)航帶來了極大的便利[27]。

6 NIRF染料的應(yīng)用前景

多模態(tài)成像策略為NIRF染料的應(yīng)用提供了良好的前景，可能實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的早期、準(zhǔn)確、全面診斷。結(jié)合多模態(tài)NIRF成像技術(shù)，不僅可以通過術(shù)中導(dǎo)航對腫瘤有效切除，而且可對抗腫瘤藥物和放療的治療效果進(jìn)行評價(jià)。但是，現(xiàn)有NIRF染料的光量子產(chǎn)能、熒光基團(tuán)的強(qiáng)度、組織的穿透性能、熒光的穩(wěn)定性以及染料與目標(biāo)靶點(diǎn)的親和力等有待進(jìn)一步改善和提升。針對上述問題，研究者通過引入強(qiáng)親水性的磺酸基團(tuán)等方式改善NIRF染料的水溶性[26]。除此之外，凈電荷為零的兩性粒子的應(yīng)用，也能改善NIRF染料的特性，如凈電荷粒子不與血清結(jié)合，具有超低的非特異性組織背景，并且能快速地從體內(nèi)代謝。

在提高NIRF染料腫瘤靶向性方面，開展腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的關(guān)鍵病理生理學(xué)差異將有助于提高染料對腫瘤的選擇性[40]；另外，一些NIRF染料如花菁染料和卟啉衍生物，已經(jīng)成為癌癥光動力治療的潛在光敏劑[41]；還有一些具有腫瘤靶向性的多模態(tài)NIRF染料可通過進(jìn)一步的共軛修飾作為腫瘤治療藥物的載體[31]。總之，NIRF在腫瘤的早期診斷中顯示出良好的應(yīng)用潛能。

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