基于微小RNA調(diào)控探討中醫(yī)藥延緩腎纖維化機制?

尹佳琦，魏明剛

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 蘇州 215006)

慢性腎衰竭是威脅人類生命的主要疾病之一，且近年來發(fā)生率逐年上升。慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)則是導致慢性腎衰竭的主要病因。最新流行病學表明，我國CKD患病率約為10.8%[1]，據(jù)此可推算我國CKD患者超過1億人。由于慢性腎衰竭目前仍無有效的治療手段，依賴血液透析、腎移植等替代治療不僅增加患者病痛和家庭經(jīng)濟負擔，而且加重社會醫(yī)療負擔，嚴重阻礙國家經(jīng)濟發(fā)展。因此，CKD的防治是世界各國所面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一。CKD發(fā)展為慢性腎衰竭的必經(jīng)之路是腎纖維化。腎纖維化早期可表現(xiàn)為腎臟局部炎癥,隨著病情發(fā)展出現(xiàn)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM) 異常積聚,促使腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，最終導致腎功能逐漸下降直至喪失而發(fā)展為慢性腎衰竭。因此，明確腎纖維化的病變機制、延緩CKD病變發(fā)展及保護腎臟功能是減少慢性腎衰竭發(fā)病率和患病率的關(guān)鍵。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約22個核糖核苷酸組成的單鏈、非編碼蛋白質(zhì)RNA，具有高度的保守性和單一的基因集簇性，在動植物細胞分化、增殖、凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，參與哺乳動物約30%蛋白質(zhì)編碼基因表達。miRNA在腎纖維化進程中起關(guān)鍵作用，中醫(yī)藥在延緩腎纖維化方面與TGF-β/Smads等信號通路關(guān)系密切。由此推斷，miRNA是中醫(yī)藥延緩腎纖維化直接或間接介質(zhì)，是治療CKD的重要靶點，值得深入探討。

1 miRNA對纖維化相關(guān)細胞因子的影響

miRNA可通過相關(guān)細胞因子的調(diào)控影響腎纖維化的進程。在生理情況下，細胞因子等構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)處于平衡狀態(tài)，但在病理情況下這一平衡被打破。參與腎纖維化常見的細胞因子有轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、結(jié)締組織生長因子(connectibe tissue growth factor, CTGF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)和核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)等。

1.1 miRNA對TGF-β的調(diào)控作用

TGF-β是目前作用最明確的致腎纖維化因子，其雙刃劍作用表現(xiàn)在正常表達時能抑制炎癥反應(yīng)和細胞增殖，而過度表達時則可引起器官纖維化等病理性改變。TGF-β促腎纖維化主要表現(xiàn)在刺激效應(yīng)細胞分泌大量ECM；通過抑制ECM降解酶的活性使ECM成分的降解減少；促進肌成纖維細胞增殖，使ECM成分的合成和分泌增加。

Kato、Chung等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)，miR-192通過下調(diào)Smads相互作用蛋白1 (Smad interacting protein 1,SIP1/ZEB2)來增加TGF-β誘導的膠原蛋白(Collagen,Col)表達，介導腎纖維化的發(fā)生。Zhong等[4]在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miR-21能通過抑制Smad7來提高TGF-β1和NF-κB信號通路的活性，還能增加Col1、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、TNF-α的表達，促進腎纖維化的發(fā)生。

Wang等[5-6]發(fā)現(xiàn)，在NRK-52E中miR-29家族能明顯降低TGF-β1誘導的Col I、III、IV，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及波形蛋白(Vimentin)的表達。let-7b能減少Smad3活性并明顯降低Col I、IV和FN的表達，通過調(diào)節(jié)TGF-β受體(TGF-β receptor，TGFβR)抑制TGF-β1的信號通路延緩腎纖維化。Wang、Xiong等[7-8]證實，在NRK-52E中，miR-200家族能通過抑制E盒結(jié)合鋅指蛋白1 (zinc finger Eboxbinding homeobox1, ZEB1)和ZEB2的表達以減少TGF-β誘導EMT的發(fā)生，提高上皮細胞標志蛋白上皮鈣黏素(epithelial cadherin, E-cadherin)的表達，并降低Vimentin、FN、α-SMA和ColI、IV的表達。

多種miRNAs參與TGF-β的調(diào)控，miR-192、miR-21等miRNA促使腎纖維化的發(fā)生，而miR-29、miR-200家族、let-7b等miRNA延緩腎纖維化的進程。

1.2 miRNA對CTGF的調(diào)控作用

CTGF在人體多種組織器官中廣泛表達，尤其在腎臟中表達最豐富。病理狀態(tài)下，CTGF的表達與器官纖維化有密切聯(lián)系。CTGF在腎纖維化進程中主要有以下幾種表現(xiàn)：一是CTGF具有促絲分裂原的作用，使腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細胞或肌成纖維細胞；二是刺激ECM發(fā)生異常積聚；三是CTGF與TGF-β相互調(diào)節(jié)。CTGF作為TGF-β的下游介質(zhì)可以直接激活TGF-β信號通路，而TGF-β促使CTGF表達增加。CTGF具有保守且單一的生物學活性，因此通過直接拮抗CTGF來治療腎纖維化，可能是一種特異、有效的方法。Koga、Wang、Chen等[9-11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19 a、miR-19b、miR-26 a、miR-26b和miR-30c的靶基因是CTGF，這些miRNAs可以直接作用于CTGF的3’端UTR來抑制CTGF蛋白表達，并能使TGF-β/Smads信號通路減弱，從而抑制ECM成分(如Col、FN)異常積聚和α-SMA、Vimentin表達增加，進一步延緩器官纖維化。

CTGF的表達與miRNA的調(diào)控存在密切聯(lián)系， miR-19、miR-26、miR-30等miRNA能降低CTGF水平，從而減慢腎纖維化進程。

1.3 miRNA對TNF-α的調(diào)控作用

TNF是一種具有廣泛生物學活性的細胞毒細胞因子。TNF-α在腎纖維化進程中的主要作用是，促進巨噬細胞浸潤至腎間質(zhì)，并誘導巨噬細胞中促纖維化的相關(guān)細胞因子釋放增加；聚集炎癥細胞；刺激成纖維細胞增殖，促進ECM成分的合成和分泌；TNF-α與NF-κB的相互作用。McDaniel等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155能促使脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的TNF-α增多和器官纖維化發(fā)生。Zarjou等[13]發(fā)現(xiàn)，UUO小鼠模型中，經(jīng)TNF-α誘導的腎小管上皮細胞中miR-21明顯上調(diào)，而增加miR-21的表達也能促使TNF-α和Col的表達上調(diào)，進一步促使腎纖維化的發(fā)生。Zheng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，增加miR-148 a的表達可以減少TNF-α和IL-1β的釋放。Tili等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b能直接作用于TNF-α的3’端UTR以抑制TNF-α的表達。Lan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞中，miR-132的增加可以明顯抑制NF-κB、TNF-α和IL-6的表達。

TNF-α與器官纖維化的關(guān)系十分密切，而miRNA對TNF-α有重要的調(diào)控作用。miR-155、miR-21等miRNAs能通過誘導TNF-α加快器官纖維化，而miR-148 a、miR-125b、miR-132等可通過抑制TNF-α的表達來減緩纖維化的發(fā)生。

1.4 miRNA對NF-κB的調(diào)控作用

NF-κB是細胞中廣泛存在的重要核轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，具有接受外部信號后快速由細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)移的顯著特點，能夠參與細胞分化、凋亡及炎癥反應(yīng)等。NF-κB能直接或間接地影響腎纖維化發(fā)生，主要表現(xiàn)在 TGF-β1與NF-κB相互影響，并促使ECM異常積聚，增加TNF-α的表達，也能被TNF-α誘導，加快EMT進程并促進成纖維細胞的增殖。Feng等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-126通過NF-κB通路明顯降低IκBα的表達并增加NF-κB的表達。Murphy等[18]研究發(fā)現(xiàn)，let-7 a以直接破壞NF-κB抑制劑的穩(wěn)定性來激活NF-κB信號通路，使TNF-α表達增加。而miR-125b則增強NF-κB抑制劑的穩(wěn)定性，從而抑制NF-κB信號通路及TNF-α的表達。Wei等[19]證實，miR-26 a能抑制NF-κB活性，減少ColI、CTGF表達。Bhaumik等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-146通過NF-κB信號通路上游TNF受體相關(guān)因子和IL-1受體相關(guān)激酶來降低NF-κB活性。

NF-κB與器官纖維化關(guān)系密切，miRNA對NF-κB的調(diào)節(jié)作用能影響腎纖維化的進程。如miR-126、let-7 a等miRNA能促進NF-κB激活，而miR-26 a、miR-125b、miR-146等能抑制NF-κB激活。

miRNA在腎纖維化的發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，miRNA能通過對TGF-β、 CTGF、TNF、NF-κB等腎纖維化相關(guān)細胞因子及其信號通路的調(diào)控作用來影響EMT進程和ECM成分異常積聚，從而進一步延緩或加速腎纖維化的發(fā)展。

2 中醫(yī)藥對miRNA的調(diào)控機制及通過調(diào)控miRNA對腎纖維化的作用

2.1 中醫(yī)藥可通過Dicer酶發(fā)揮對miRNA的調(diào)控作用

miRNA在細胞核內(nèi)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)，繼而在Drosha酶的作用下生成約70個核苷酸長度組成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)，通過Dicer酶進一步切割為成熟的約22個核苷酸組成的單鏈、非編碼miRNA。Dicer酶是原始miRNA轉(zhuǎn)化為成熟miRNA的關(guān)鍵酶。有研究證實，小鼠卵母細胞Dicer酶的特異性缺失會造成母體miRNA遺傳的缺失[21]。Dicer酶不僅是生成成熟miRNA的關(guān)鍵酶，許多研究證實Dicer酶還具有調(diào)控miRNA表達的作用。Rupaimoole等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧狀態(tài)下Dicer酶的表達下調(diào)，對miRNAs產(chǎn)生的調(diào)控作用導致腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移增加。Yao等[23]發(fā)現(xiàn)，在慢性缺氧條件下Dicer酶能調(diào)控miR-143和miR-155的表達，以促進細胞葡萄糖代謝的影響。Hartmann等[24]證實，Dicer酶通過調(diào)控miR-103抑制Kruppel樣因子4，從而促進部分內(nèi)皮細胞適應(yīng)不良和動脈粥樣硬化。Kuehbacher等[25]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染Dicer酶的小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)，能抑制miRNA的生物合成，Dicer酶的siRNA可以降低let-7f和miR-27b表達，從而對血管生成產(chǎn)生影響。這些研究證實，Dicer酶對miRNAs的調(diào)控機制能對多種細胞(如腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞等)產(chǎn)生影響。

研究表明，中藥對Dicer酶具有調(diào)控作用。Yang等[26]發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯通過干擾Dicer酶來調(diào)節(jié)miR-126、miR-221、miR-222表達，從而上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達，以提高對局灶性腦缺血后間充質(zhì)干細胞血管生成的影響。Sun等[27]研究證實，雷至膠囊能夠減少Dicer酶的表達，調(diào)控miR-23 a、 miR-300-3p、miR-24和miR-30c表達，并對腎組織足細胞裂隙膜關(guān)鍵結(jié)構(gòu)分子腎單位、足細胞和骨架蛋白有明顯的保護作用，修復嘌呤霉素氨基核苷腎病模型對足細胞結(jié)構(gòu)和功能方面造成的損傷，減少尿蛋白。

因此可以認為，中藥方劑通過中藥復合物及其活性成分對機體內(nèi)Dicer酶表達的調(diào)控作用，進而發(fā)揮其對miRNA的調(diào)節(jié)作用，從而影響miRNA的表達水平，進一步對細胞的分化、增殖、凋亡等發(fā)揮著重要作用。其作用機制可能是中藥通過調(diào)控miRNA表達，調(diào)整機體機能及治療疾病的重要機制和作用靶點。

2.2 腎纖維化與中醫(yī)藥的聯(lián)系

腎纖維化的防治與中醫(yī)藥有著密切聯(lián)系，腎纖維化的形成貫穿于各種CKD發(fā)展為終末期腎衰竭的始終。CKD屬于中醫(yī)水腫、腰痛、尿血、關(guān)格、虛勞等疾病范疇，其病因病機為本虛標實，但該病病機錯綜復雜，病位涉及腎、肝、脾、肺、心諸臟，發(fā)病主要與肺、脾、腎三臟關(guān)系密切。根據(jù)現(xiàn)代解剖學可知，腎臟滿布血管網(wǎng)，故腎纖維化受到血流動力學的影響。這些細小且量多的血管網(wǎng)屬于中醫(yī)孫絡(luò)范疇，孫絡(luò)是絡(luò)脈中最細小的分支，主要作用是輸布氣血以濡養(yǎng)全身組織，病理狀態(tài)下血液運行不利易造成瘀阻，故血瘀是CKD最容易出現(xiàn)的病因，為邪實之首。CKD中所出現(xiàn)的腎臟病理學改變，如血管袢、細胞增殖、Col沉積、血栓形成等都在血瘀的致病結(jié)果中?！端貑枴匪赜小靶爸鶞悾錃獗靥摗钡陌l(fā)病觀，氣虛則推動血液不利易造成血瘀，故從中醫(yī)發(fā)病病機的角度來說，CKD常見于氣虛血瘀。

近年來課題組通過一系列的實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、當歸、川芎、牛膝等中藥可以治療氣虛血瘀且具有多靶點和精準治療的特色，這些中藥可以減少Col和FN等ECM成分異常積聚，抑制TGF-β1信號通路，減少腎小管上皮細胞凋亡等，對腎臟具有保護作用，從而有效延緩腎纖維化進程。

2.3 中醫(yī)藥通過調(diào)控miRNA對腎纖維化作用

近年來，關(guān)于中藥對腎纖維化的影響已有報道。黃芪甲苷(astragaloside-IV，AS-IV)是黃芪的主要活性成分之一，對延緩腎纖維化起到了關(guān)鍵作用；Zhu等[28]發(fā)現(xiàn)，AS-IV可以降低大鼠血肌酐、尿素氮并減少TGF-β、CTGF、FN的表達來延緩腎纖維化；Che等[29]證實，AS-IV能通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號通路的活性和TGF-β1誘導NF-kB信號通路激活以減少α-SMA和ECM成分，如ColIV、FN的表達延緩腎纖維化；Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，AS-IV通過調(diào)控TGF-β/Smads信號通路來下調(diào)TGF-β1、α-SMA表達及減少Smad2/3的磷酸化延緩腎纖維化；Chen等[31]發(fā)現(xiàn)，AS-IV能明顯上調(diào)miR-21轉(zhuǎn)錄水平，促進成纖維細胞增生使模型大鼠傷口愈合；Zhang等[32]研究表明，AS-IV能增加miR-122的表達并減少miR-221的表達以治療肝細胞癌。

阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是當歸的主要活性成分之一，有抗炎、抗氧化、抗癌等生物活性。在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A可以直接或間接地抑制腎纖維化發(fā)展；Wei等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在NRK-52E中，F(xiàn)A通過調(diào)控Smad2/3、ILK及Snail信號通路以明顯抑制TGF-β1，使TGF-β1誘導E-cadherin的表達增加而α-SMA表達減少，從而進一步抑制EMT進程；Xu等[34]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A能通過抑制TGF-β1的分泌減少細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2的磷酸化作用及Smad的轉(zhuǎn)錄活性，明顯減少ColI和FN表達，進一步抑制肝星狀細胞活性。

川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是川芎的主要活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，TMP能有效防治腎小管間質(zhì)纖維化，延緩腎衰竭的發(fā)生發(fā)展；Wu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，TMP能阻斷上皮細胞的轉(zhuǎn)分化，使α-SMA表達明顯減少，E-cadherin表達明顯增加，從而抑制EMT進程，進一步延緩腎纖維化；Lu和Yuan等[36-37]發(fā)現(xiàn),在大鼠UUO模型中，TMP延緩腎纖維化的作用機制表現(xiàn)在兩方面：一是抑制TGF-β1、CTGF、α-SMA表達和Col沉積，二是增加Smad7、SnoN蛋白表達，表明川芎嗪能有效防治腎小管損傷,延緩腎間質(zhì)纖維化；Cheng等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在NRK-52E中，TMP能抑制阿霉素誘導的NF-κB激活，減少細胞凋亡，從而延緩腎小管間質(zhì)纖維化；Li等[39]發(fā)現(xiàn)，TMP能增加miR-9表達，且TMP與miR-9聯(lián)合治療能明顯降低α-SMA和ColI的表達，抑制肝纖維化。

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是牛膝的主要活性成分之一。研究表明，OA能抗氧化應(yīng)激，減少細胞凋亡和ECM表達等，對腎臟有保護作用，并能延緩腎纖維化；Hong等[40]在環(huán)孢素A誘導的小鼠腎損傷實驗中發(fā)現(xiàn)，OA能明顯抑制α-SMA表達增加，還能促使抗氧化關(guān)鍵因子核因子相關(guān)因子2的表達,從而增加細胞的抗氧化應(yīng)激能力，減少細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而延緩腎纖維化；Lee等[41]證實，OA抑制并改善高糖誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，還可抑制TGF-β、Smad2/3信號通路及α-SMA表達并減少細胞凋亡，從而減緩腎纖維化和蛋白尿的產(chǎn)生。Zhang等[42]表明，OA可以降低CTGF、TGF-β及TNF-α水平，明顯降低ColⅠ和ColⅢ表達，從而抑制腎纖維化；Zhao等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細胞中OA可以通過調(diào)節(jié)miR-122的表達起到抗癌細胞增殖的作用；Yi等[44]研究發(fā)現(xiàn)，OA能誘導miR-132表達增加以發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)的作用。OA通過抑制TGF-β、smad2/3、α-SMA的表達及ECM異常積聚，調(diào)控miRNAs以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡、降脂等多種作用，在延緩腎纖維化的機制方面值得探究。

綜上我們可推測，miRNA可以作為中藥方劑及其組分直接或間接介質(zhì)并成為治療CKD的重要靶點，從而產(chǎn)生對腎臟的保護作用以延緩腎纖維化的進程。

3 結(jié)語

慢性腎衰竭嚴重威脅著人類的生命健康，而CKD是導致慢性腎衰竭的主要原因。腎纖維化是各種CKD發(fā)展為慢性腎衰竭的必經(jīng)之路。CKD在我國乃至世界的發(fā)病率都較高，且至今沒有有效的治療手段，漫長的病程加重患者家庭和社會的經(jīng)濟負擔，因此對腎纖維化病變機制的研究就顯得尤為重要。腎纖維化的機制是延緩腎纖維化病變發(fā)展、保護腎臟功能和減少慢性腎衰竭發(fā)病率與患病率的關(guān)鍵。

腎纖維化的發(fā)病機制主要體現(xiàn)在纖維化相關(guān)細胞因子所促進EMT進程及ECM異常積聚等方面，各細胞因子相互影響、相互作用，僅僅調(diào)控單一環(huán)節(jié)很難有理想的治療效果。結(jié)合CKD的研究現(xiàn)狀可發(fā)現(xiàn)，miRNA與腎纖維化的發(fā)生機制有密切聯(lián)系。miRNA通過調(diào)控以TGF-β/Smads為代表的信號通路影響腎纖維化進程，中藥方劑及其組分在延緩腎纖維化方面的作用與TGF-β/Smads等信號通路關(guān)系密切，因此miRNA和中藥活性成分的關(guān)系值得探討與研究。課題組研究表明，芪歸益腎方能通過抑制TGF-β/Smad/ILK信號傳導通路來明顯增加功能蛋白nephfin的表達，并減少Vimentin表達，保護足細胞的完整性，減輕腎小管-間質(zhì)損傷以保護腎功能，從而抑制腎纖維化的發(fā)展[45-46]。此外，芪歸益腎方通過對TGF-β1 /Smads信號通路及其下游信號通路磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的抑制，以減少ECM成分的異常聚集，從而延緩腎纖維化進程[47]。

綜上，可以把miRNA視為中藥方劑及其組分延緩腎纖維化的直接或間接介質(zhì)，通過對單味中藥及其有效提純物、中藥復方的應(yīng)用及多途徑、多層次、多靶點的精準治療，發(fā)揮中醫(yī)藥延緩腎纖維化的重要作用，把中醫(yī)藥運用到治療腎臟疾病的過程中。而在現(xiàn)有的研究中，miRNA與中醫(yī)藥相關(guān)延緩腎纖維化的研究較少，是目前探索研究的重點。

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