便攜式魚肉抗菌藥物殘留量拉曼檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)研究

滕官宏偉，蔣 晗，張雷蕾，朱 誠(chéng)

(中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

受大規(guī)模、高密度、集約化養(yǎng)殖模式的制約，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中亂用濫用抗生素、殺蟲劑等漁藥，導(dǎo)致養(yǎng)殖水產(chǎn)品中藥物殘留的現(xiàn)象嚴(yán)重，由此引發(fā)的水產(chǎn)品安全問(wèn)題層出不窮.為了提高水產(chǎn)品食用安全信息的完備性，有效保證水產(chǎn)品食用性、可靠性和安全性，亟需解決抗菌藥物等化學(xué)污染物殘留快速檢測(cè)、控制及安全性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵問(wèn)題.常規(guī)檢測(cè)手法如分子印跡技術(shù)、免疫分析法、色譜法及質(zhì)譜法等，存在檢測(cè)效率低、樣品破壞、檢測(cè)滯后等缺點(diǎn)[1-3].因此，如何實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品化學(xué)污染物殘留的快速無(wú)損檢測(cè)成為當(dāng)務(wù)之急.

作為食品安全檢測(cè)最具潛力的新方法之一，光譜技術(shù)具有快速、實(shí)時(shí)和無(wú)損傷三個(gè)技術(shù)特征，在水產(chǎn)食品品質(zhì)安全檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮出巨大的潛力[4-5].Soroush H等[6]為了檢測(cè)水中福美雙、甲基對(duì)硫磷和孔雀石綠，設(shè)計(jì)了無(wú)泵式流動(dòng)SERS微型檢測(cè)系統(tǒng)，結(jié)果表明三種藥物最低檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-9、5×10-6、0.1×10-9，對(duì)混合的三種殺菌劑也可以較為明顯的區(qū)分.美國(guó)密蘇里大學(xué)Li等[7]利用樹(shù)枝狀銀納米顆粒為基底，研究了溶液中氯霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星三種抗生素SERS檢測(cè)限，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，環(huán)丙沙星的檢測(cè)限為20×10-9，并且可以將三種抗生素的混合溶液區(qū)別開(kāi).光譜檢測(cè)技術(shù)在水產(chǎn)品品質(zhì)安全檢測(cè)的應(yīng)用上非常廣泛[8-10].上海海洋大學(xué)海洋藥物與健康食品研究團(tuán)隊(duì)，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行水產(chǎn)品中多殘留漁藥的檢測(cè)研究中取得了很好的成果[11-13].馬海寬等[16]以銀溶膠為表面增強(qiáng)拉曼活性基底，實(shí)現(xiàn)了比目魚肉中磺胺類抗生素的痕量檢測(cè)，在試驗(yàn)中，根據(jù)磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶分別在1 102 cm-1和1 134 cm-1處的特征拉曼信號(hào)，檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為1×10-6.

本文通過(guò)自行設(shè)計(jì)拉曼光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，選取磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、恩諾沙星和氟苯尼考這四種常用抗菌藥物為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)得到相應(yīng)的光譜圖并對(duì)其進(jìn)行特征峰識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)這四種抗生素在大黃魚的殘留狀況定性判別，并分析此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際的可行性.

1 光學(xué)無(wú)損檢測(cè)裝置構(gòu)成及工作原理

本文研制的便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測(cè)系統(tǒng)，包括光源系統(tǒng)、信號(hào)采集系統(tǒng)和載物裝置三大模塊.

1.1 光源系統(tǒng)模塊

光源系統(tǒng)是光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的重要部分，本試驗(yàn)采用基于外腔式體光柵技術(shù)500 mW的785 nm激光器(Laser-785, Ocean optics)作為激發(fā)光源，該激光器集成了反饋式穩(wěn)定功率模塊和內(nèi)置半導(dǎo)體制冷，具有窄線寬、強(qiáng)度穩(wěn)定的激光輸出及可抑制待測(cè)樣品熒光等特性，從而可以保證檢測(cè)系統(tǒng)的精度和魯棒性.

1.2 信號(hào)采集系統(tǒng)模塊

該模塊采用了可選擇配置狹縫和光柵類型的微型拉曼光纖光譜儀(USB2000-VIS-NIR，Ocean optics).為了實(shí)現(xiàn)低照度條件響應(yīng)，配置狹縫為50 um，探測(cè)器：TE制冷背照薄型面陣CCD陣列，所覆蓋有效拉曼光譜范圍：340～3 000 cm-1.同時(shí)為了采集785 nm激發(fā)波長(zhǎng)下樣品的斯托克斯光譜，配置有780 nm長(zhǎng)通濾波片.儀器光譜分辨率為5 cm-1，信噪比1000∶1.非浸入式拉曼光纖探頭(SPL-RPB-785，Ocean optics)，該探頭擁有深度激光譜線覆蓋，瑞利線光學(xué)密度OD=6.所采用Y型光纖(數(shù)值孔徑0.22)一端與光纖探頭連接，另一端與光譜儀的輸入端和激光器的輸出端連接.

1.3 載物裝置模塊

高精度樣品高度調(diào)節(jié)載物臺(tái)由探頭夾持器、樣品放置平臺(tái)和電動(dòng)升降臺(tái)組成.由于被檢樣品表面和鏡頭之間距離的變化會(huì)引起光譜強(qiáng)度的差異，并影響整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性，因此通過(guò)激光位移傳感器(CD22-100-485, Optex Fa CO Ltd, Japan)，保持檢測(cè)距離一致.

整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)置于一個(gè)封閉的暗箱內(nèi)，避免外界光干擾，系統(tǒng)示意圖如圖1.

圖1 水產(chǎn)品品質(zhì)安全光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic diagram of the optical detecting system for quality and safety of aquatic products

1.4 工作原理

激光器產(chǎn)生穩(wěn)定的785 nm激光耦合進(jìn)Y型光纖的光源端，并傳輸?shù)綑z測(cè)探頭，照射到待測(cè)樣品表面，所產(chǎn)生的散射光再由拉曼探頭獲取，通過(guò)濾除瑞利散射后進(jìn)行光柵分光，然后投射到CCD探測(cè)器上，經(jīng)過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換后傳送至計(jì)算機(jī)，從而獲取到拉曼位移光譜信號(hào).通過(guò)光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取樣品及不同種類化學(xué)污染物的光譜特征參數(shù)，最終對(duì)待測(cè)樣品殘留的化學(xué)污染物進(jìn)行定性識(shí)別分析.

1.5 系統(tǒng)軟件開(kāi)發(fā)

便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測(cè)系統(tǒng)軟件的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)是基于windows操作系統(tǒng)MFC(Microsoft Foundation Classes)基礎(chǔ)類庫(kù)完成的，主要包括光學(xué)信號(hào)采集、光譜數(shù)據(jù)保存處理、標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù)查詢、以及人機(jī)交互界面等功能.如圖2所示.

檢測(cè)參數(shù)設(shè)置模塊主要是針對(duì)光譜儀的積分時(shí)間、平均次數(shù)等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置.數(shù)據(jù)處理模塊是通過(guò)MATLAB和C++混合編程實(shí)現(xiàn)的，可執(zhí)行光譜數(shù)據(jù)自動(dòng)導(dǎo)入、實(shí)時(shí)顯示、保存以及熒光剔除、光譜去噪等預(yù)處理等命令.在化學(xué)污染物痕量檢測(cè)時(shí)，采集到的圖譜通常會(huì)存在一部分重疊，以致影響各種類殘留物質(zhì)特征峰的準(zhǔn)確識(shí)別.因此，光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理的關(guān)鍵步驟是識(shí)別重疊峰并對(duì)其進(jìn)行基線校準(zhǔn).

圖2 系統(tǒng)軟件功能模塊Figure 2 Function module of the system software

2 裝置試驗(yàn)測(cè)試

2.1 試劑及藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

以甲醇和乙醇作為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度100 mg/L氯霉素-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、磺胺二甲基嘧啶-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、恩諾沙星-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和氟苯尼考-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液.將標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.25 μg/mL和5 μg/mL 四個(gè)梯度，共16個(gè)藥物樣品溶液.

2.2 魚肉樣品準(zhǔn)備和預(yù)處理

將購(gòu)買于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)新鮮的大黃魚為研究對(duì)象，采取其魚肉作為實(shí)驗(yàn)樣品，魚去鱗、皮后沿背脊取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肌肉塊后混勻，然后用保鮮膜裹好放在冰箱中冰凍儲(chǔ)存?zhèn)溆?取1 mg制備好的藥品溶液分別和1 g魚肉進(jìn)行充分混合勻漿處理；將乙腈作為提取及劑添加到混合物中，使?jié)B入魚肉樣本中的藥物被重新提取，再進(jìn)行離心處理取得上清液；用正己烷去除魚肉中含有一些油脂類物質(zhì)，從而減少這些物質(zhì)對(duì)光譜檢測(cè)及分析的干擾；離心去除正己烷后將待測(cè)液放在冰箱中保存[16].

2.3 檢測(cè)條件設(shè)置及光學(xué)信號(hào)獲取

采集四種藥物固體純品、不同質(zhì)量濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液及提取液的拉曼特征光譜.取適量的抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品原料固體粉末于載玻片上壓平；取適量不同藥物不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和提取液于比色皿中；將制備好的樣品置于自主設(shè)計(jì)的便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測(cè)系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)探頭與樣品表面的距離為2 mm，設(shè)置激光器的功率為500 mW，中心波長(zhǎng)為785.2 nm，設(shè)置光譜儀的平均次數(shù)為2次，積分時(shí)間為2 000 ms.利用系統(tǒng)軟件控制并采集待檢樣品的光學(xué)圖譜，再進(jìn)行光譜平滑、熒光背景扣除等預(yù)處理，將光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MATLAB2013a中進(jìn)行進(jìn)一步處理與分析.

3 結(jié)果與討論

3.1 抗菌藥物固體標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜檢測(cè)及分析

分析四種不同種類的抗菌藥物固體標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼圖譜，可以發(fā)現(xiàn)各個(gè)藥物的特征峰比較明顯，并對(duì)其各個(gè)特征峰進(jìn)行指認(rèn)歸屬，結(jié)果如圖3.

圖3 抗菌藥物固體標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜Figure 3 Spectra of pure antibactics

從圖3(a)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖分析其特征峰的相關(guān)峰歸屬，可知422 cm-1的特征峰屬于C-C伸縮振動(dòng)，745 cm-1的特征峰屬于28C和Cl2的彎曲振動(dòng)，987 cm-1的特征峰屬于苯環(huán)上的CH3和苯環(huán)上的H伸縮運(yùn)動(dòng).根據(jù)圖3(b)磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖，分析其特征峰的相關(guān)峰歸屬可知，558 cm-1的特征峰屬于C-S伸縮振動(dòng)， 818 cm-1的特征峰屬于對(duì)位二取代苯環(huán)呼吸振動(dòng)，981 cm-1的特征峰屬于C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 074 cm-1的特征峰屬于C-N伸縮振動(dòng)，1 127 cm-1的特征峰屬于SO2對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 580 cm-1的特征峰屬于對(duì)位二取代苯環(huán)伸縮振動(dòng)[17].從圖3(c)光譜圖中可以看出氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品在359.277cm-1和203.528 cm-1等處有特征峰，其中 1 140 cm-1附近為 C-SO2-C的強(qiáng)峰.此外，氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖與氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖存在很大差異.這是因?yàn)榉侥峥冀Y(jié)構(gòu)上的苯環(huán)對(duì)位硝基被甲磺酸基所取代，而氯霉素苯環(huán)上是對(duì)位硝基，所以二者相差很大.根據(jù)圖3(d)恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖，分析其特征峰的相關(guān)峰歸屬可知，421 cm-1的特征峰屬于δ(C-H)Q，619cm-1屬于υ(C-C)Q，1 233 cm-1屬于υ(C-F)，1 380cm-1屬于υa(O-C-O)，1 448 cm-1屬于υs(C=O)p，1 609 cm-1屬于υas(C=O)p[13-14].四種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品拉曼特征峰的相關(guān)峰歸屬如表1所示.

表1 四種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品拉曼特征峰的相關(guān)峰歸屬

3.2 不同濃度梯度的抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的拉曼圖譜分析

對(duì)四種不同濃度的氯霉素-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、磺胺二甲基嘧啶-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、恩諾沙星-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和氟苯尼考-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液的拉曼光譜圖進(jìn)行比較分析，以恩諾沙星-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液為例，如圖4，從圖中的特征峰可以發(fā)現(xiàn)不同濃度質(zhì)量梯度的藥物溶液的拉曼圖譜中溶劑的峰較為明顯，且不同的濃度梯度都存在著幾個(gè)相同的拉曼峰位置，根據(jù)這幾個(gè)特征峰也可以推斷出它含有那類物質(zhì).

圖4 不同濃度的恩諾沙星-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的拉曼圖Figure 4 Raman spectra of standard solutions of enrofloxacin in methanol

3.3 魚肉中藥物殘留的探測(cè)及危害識(shí)別

將具有高檢測(cè)靈敏度的光譜檢測(cè)技術(shù)與主成分分析(PCA)統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)相結(jié)合，對(duì)魚肉中不同藥物殘留提取液進(jìn)行定性分析.利用matlab中[pc,score,variance,t] = princomp(x)函數(shù)對(duì)原始光譜進(jìn)行降維，得到特征向量，在進(jìn)行主成分PCA分析后，提高特征向量的維數(shù)，能夠使提取的特征向量含有更多有利于分類魚肉樣本中殘留藥物的信息.圖為PCA散點(diǎn)分布圖，PC1、PC2、PC3分別作X、Y、Z軸.如圖5所示，代表不同藥物的數(shù)據(jù)點(diǎn)基本可以聚集到一起，但不能夠完全區(qū)分開(kāi)來(lái).分析其原因，是在魚肉樣本中提取殘留藥物時(shí)，采用乙腈作為提取劑，在一定程度上具有較為強(qiáng)烈的拉曼特征峰，對(duì)四種不同種類抗菌藥物自身的光譜峰有所掩蓋.

圖5 魚肉殘留藥物提取液拉曼光譜的主成分分析Figure 5 The Raman spectrum of principal component analysis of fish residual drug extraction

4 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)自行構(gòu)建的便攜式魚肉抗菌藥物殘留拉曼檢測(cè)系統(tǒng)，獲取魚肉中殘留藥物的光學(xué)信號(hào)，甄別出磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、恩諾沙星和氟苯尼考等四種抗生素對(duì)應(yīng)的特征峰，并對(duì)各個(gè)拉曼特征峰進(jìn)行指認(rèn)歸屬分析，實(shí)驗(yàn)得到的拉曼圖譜以及對(duì)其特征峰的歸屬信息可以作為不同種類抗菌藥物的定性鑒別依據(jù).但也存在一些問(wèn)題亟待進(jìn)一步改進(jìn)：1)嘗試結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，使魚肉復(fù)雜樣品中抗菌藥物的最低檢測(cè)濃度得以突破；2)進(jìn)一步改進(jìn)熒光背景消除方法，有效消除不同樣品的組間數(shù)據(jù)波動(dòng)；3)提高檢測(cè)精度和準(zhǔn)確度，消除探頭到樣本的距離對(duì)光譜數(shù)據(jù)采集的影響.

通過(guò)對(duì)不同抗菌藥物在魚肉殘留中的拉曼光學(xué)檢測(cè)的初探，為進(jìn)一步研發(fā)功能完備、檢測(cè)精度高、檢測(cè)速度快、可移植性好的小型便攜的水產(chǎn)品污染物檢測(cè)儀器，實(shí)現(xiàn)漁業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈的藥物有害物質(zhì)殘留控制和品質(zhì)安全檢測(cè)提供了研究基礎(chǔ).

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