血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑對糖尿病大鼠胰島功能和纖維化的影響及其作用機(jī)制

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多個(gè)大型臨床研究已發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)阻斷劑可降低糖尿病高危人群的新發(fā)糖尿病發(fā)生率[1-2]，研究已證實(shí)胰腺也存在局部RAS[3]，糖尿病發(fā)生時(shí)胰腺局部RAS被異常激活，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能受損[4-7]。前期研究也表明阻斷RAS可減輕胰島細(xì)胞的凋亡及氧化應(yīng)激，改善胰島素抵抗，發(fā)揮抗糖尿病作用[8-9]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠參與多種生物學(xué)效應(yīng)，包括參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積、過度纖維化等重要的生物學(xué)活動(dòng)。有報(bào)道TGF-β1/Smads過度激活與心肌病、糖尿病腎病以及非糖尿病性肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[10-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)可通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)來改善胰腺炎動(dòng)物模型胰腺的纖維化[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)以高脂高熱量飲食喂養(yǎng)，配合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型，然后給予ARB類藥物(氯沙坦)進(jìn)行干預(yù)，觀察血糖、胰島素分泌、胰島素抵抗及胰島的病理形態(tài)學(xué)變化，并從基因和蛋白兩方面檢測胰島局部TGF-β1、Smad7以及反映纖維化的I型膠原(collagen type I，Collagen I)的表達(dá)，探討阻滯血管緊張素Ⅱ 1型受體對胰島纖維化的影響、對胰島功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立和分組 180 g～220 g的Wistar雄性大鼠26只，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)選取8只作為正常對照組，以普通飼料喂養(yǎng)，余18只喂以高脂高熱量飼料，8周后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)，72 h后大鼠尾靜脈采血，糖尿病模型初步確定的血糖值為≥16.7 mmol/L。由于應(yīng)激、環(huán)境等因素的影響，各組空腹血糖和隨機(jī)血糖還需在一周后進(jìn)行復(fù)測，測得的隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，空腹血糖≥11.1 mmol/L，且伴有多尿、多飲、多食現(xiàn)象的大鼠可認(rèn)為造模成功，其中有16只造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組和氯沙坦干預(yù)組，各組8只。使用氯沙坦(默沙東公司)30 mg/(kg·d)對干預(yù)組大鼠進(jìn)行灌胃治療，同時(shí)以等量生理鹽水對正常對照組和糖尿病對照組大鼠灌胃，干預(yù)8周。

1.2 方法 每周檢測血糖和體重，每日觀察動(dòng)物的食欲、活動(dòng)力、體溫及其他反應(yīng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)ELISA法檢測血清胰島素的濃度，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。取胰腺組織做病理切片，HE染色觀察胰島形態(tài)的變化，免疫組化法觀察TGF-β1、Smad7及Collagen I的蛋白表達(dá)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TGF-β1、Smad7及Collagen I 的mRNA表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況、血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的變化 建模后模型組大鼠血糖明顯升高，并出現(xiàn)多尿、多飲、多食、體重減輕的癥狀，用氯沙坦干預(yù)后，血糖有所下降，多尿、多飲、多食癥狀改善，體重?zé)o明顯變化。與正常對照組相比，糖尿病對照組大鼠的胰島素分泌量明顯減少，胰島素抵抗指數(shù)升高。氯沙坦干預(yù)組的胰島素較糖尿病對照組增加，胰島素抵抗指數(shù)降低。詳見表1。

表1 各組大鼠血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)比較(±s)

2.2 各組大鼠胰島組織形態(tài)學(xué)觀察 正常對照組大鼠胰島形態(tài)正常，呈圓形或類圓形，結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)分布均勻，β細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。糖尿病對照組的胰島β細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胰島形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，結(jié)構(gòu)變得紊亂，纖維結(jié)締組織成分可見。用氯沙坦干預(yù)后，胰島病變較糖尿病對照組減輕，組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，但未完全恢復(fù)正常。詳見圖1。

正常對照組 糖尿病對照組 氯沙坦干預(yù)組

圖1大鼠胰島HE染色(×400)

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果分析 TGF-β1蛋白表達(dá)為深棕色或黃褐色，主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)和(或)胞膜，偶見胞核著色，Smad7蛋白表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中(少數(shù)位于胞核中)，Collagen I蛋白表達(dá)于胞質(zhì)中，呈棕色或深橘黃色顆粒。免疫組化結(jié)果表明糖尿病對照組大鼠的胰腺組織中TGF-β1和Collagen I蛋白的表達(dá)增加，Smad7蛋白表達(dá)減少。用氯沙坦干預(yù)后前兩者表達(dá)減少，后者表達(dá)增加。詳見圖2和表2。

正常對照組 糖尿病對照組 氯沙坦干預(yù)組

圖2 TGF-β1、Smad7和Collagen I在胰島表達(dá)的免疫組化照片(×400)

表2 TGF-β1、Smad7和Collagen I蛋白在胰島中的表達(dá)情況(±s)

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析 與正常對照組相比，糖尿病對照組TGF-β1和Collagen I 的mRNA表達(dá)增多，氯沙坦干預(yù)組的表達(dá)較糖尿病對照組減少；Smad7 mRNA表達(dá)糖尿病對照組較正常對照組減少，氯沙坦干預(yù)組較糖尿病對照組增多。詳見表3。

表3 TGF-β1、Smad7和Collagen I mRNA在胰島的表達(dá)情況(±s)

3 討 論

眾所周知，RAS是重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，近年來，隨著在分子生物學(xué)和基因組學(xué)水平對RAS研究的不斷深入，證明了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與多重因素導(dǎo)致局部RAS激活有關(guān)。研究證實(shí)，糖尿病時(shí)胰島局部RAS 活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于循環(huán)系統(tǒng)，這也說明局部RAS 在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用。Frantz等[16]報(bào)道雷米普利能改善高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6鼠胰島形態(tài)和功能，改善糖調(diào)節(jié)和胰島素抵抗。Takami 等[17]報(bào)道ACEI 和ARB能夠降低糖尿病的發(fā)生率，并且能夠降低尿微量白蛋白與肌酐的比率。Bernardi等[18]報(bào)道RAS阻斷劑可改善糖尿病心肌病。本實(shí)驗(yàn)使用ARB類藥物氯沙坦進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其能改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠胰島分泌功能及胰島素抵抗，發(fā)揮抗糖尿病作用。

目前認(rèn)為糖尿病的發(fā)生與胰腺纖維化有關(guān)，胰島纖維化可能會(huì)干擾β細(xì)胞的信息傳遞，從而使胰島素分泌量降低。有研究表明高血糖狀態(tài)時(shí)TGF-β1表達(dá)增高，可參與糖尿病纖維化的進(jìn)程，其主要作用在于促進(jìn)葡萄糖與氨基酸在成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解的進(jìn)行，從而導(dǎo)致ECM的合成明顯增加[19]。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型胰島組織中，48 h即可檢測到TGF-β1mRNA，其蛋白含量在48 h達(dá)到峰值并一直持續(xù)到72 h[20]。在TGF-β1表達(dá)缺陷的大鼠胰腺纖維化模型中以及應(yīng)用TGF-β1的中和抗體作用的胰腺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白的分泌量降低，從而延緩了纖維化的進(jìn)程[21]。Smads是TGF-β1下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其中Smad7為抑制性蛋白，可阻止TGF-β1型受體對受體活化的Smad蛋白的磷酸化，發(fā)揮抑制作用。本研究從基因和蛋白兩方面均進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)糖尿病對照組TGF-β1表達(dá)增高，保護(hù)性因子Smad7表達(dá)下降。而用氯沙坦干預(yù)后，TGF-β1含量降低，Smad7表達(dá)增加。表明高血糖狀態(tài)下TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，氯沙坦可通過下調(diào)TGF-β1，上調(diào)Smad7，抑制該途徑的效應(yīng)。胰腺纖維化發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)是ECM的增多與沉積，ECM主要包括膠原、糖蛋白、彈性蛋白以及蛋白聚糖四種組分，膠原又包含有多種表型，包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型，其中含量最為豐富的是Collagen I。有研究報(bào)道局部血管緊張素Ⅱ能通過AT1 受體使TGF-β1和結(jié)締組織生長因子等前硬化因子的表達(dá)上調(diào)，從而增加膠原蛋白在細(xì)胞外的沉積，最終導(dǎo)致組織器官的纖維化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病對照組大鼠胰腺Collagen I的mRNA和蛋白表達(dá)均增高，而用氯沙坦干預(yù)后，Collagen I含量減少，并且胰島的纖維化程度也得到改善，表明氯沙坦可以通過減少膠原蛋白而改善胰島纖維化，其作用可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而實(shí)現(xiàn)的。

本研究采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，用血管緊張素Ⅱ 1型受體阻滯劑氯沙坦進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)氯沙坦可增加胰島素分泌，改善胰島素抵抗，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號途徑，降低Collagen I的表達(dá)，從而減輕了胰島纖維化，發(fā)揮了抗糖尿病作用。

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