PCR—熒光探針法在沙眼衣原體泌尿生殖道感染判愈中的應(yīng)用

尤聰 劉全中 葉小英

【摘要】 目的：評估不同判愈標(biāo)準(zhǔn)下羅紅霉素治療沙眼衣原體（C.t）泌尿生殖道感染患者治愈率的差別。方法：回顧性分析2013年1月-2017年12月在贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診確診為C.t生殖道感染354例患者的臨床資料，所有患者采用羅紅霉素治療C.t感染并完成2次隨訪。臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)為臨床癥狀消失，病原學(xué)判愈標(biāo)準(zhǔn)為PCR檢測臨床標(biāo)本C.t DNA陰性，比較不同判愈標(biāo)準(zhǔn)的患者治愈情況。結(jié)果：根據(jù)臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)，354例患者中治愈283例，治愈率為79.94%；而第1、2次PCR-熒光探針法檢測的治愈率分別為73.45%和72.32%。臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)的治愈率均明顯高于第1、2次PCR-熒光探針法判愈標(biāo)準(zhǔn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.37、6.07，P=0.04、0.01）；但兩次PCR-熒光探針法判愈標(biāo)準(zhǔn)的治愈率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.18，P=0.67）。結(jié)論：PCR-熒光探針法可作為C.t泌尿生殖道感染治療后隨訪較為客觀的病原學(xué)判愈方法，推薦采用羅紅霉素治療患者療程結(jié)束后1個(gè)月復(fù)查1次。

【關(guān)鍵詞】 沙眼衣原體； 泌尿生殖道感染； PCR-熒光探針法； 羅紅霉素； 治愈率

【Abstract】 Objective：To evaluate the difference of the cure rates with different standards on the patients with chlamydia trachomatis （C.t） urogenital infection treated by Roxithromycin.Method：The clinical data of 354 patients with C.t urogenital infection diagnosed in the outpatient department of the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University from January 2013 to December 2017 were retrospectively analyzed.All patients were treated with Roxithromycin for C.t infection and followed up for two times.The disappearance of clinical symptoms was defined as the clinical standard and the negative detection of C.t DNA in clinical samples by PCR was defined as the pathogenic standard.The cure rate of patients with different standards were compared.Result：According to the clinical standard，283 cases were cured，cure rate was 79.94%，the cure rates of the first and second PCR-fluorescence probe methods were 73.45% and 72.32% respectively.The cure rate of the clinical standard was significantly higher than those of the first and second PCR-fluorescence probes，the differences were statistically significant（字2=4.37，6.07；P=0.04，0.01）.However，there was no significant difference in the cure rate between the the first and second PCR-fluorescent probes （字2=0.18，P=0.67）.Conclusion：PCR-fluorescent probe method can be carried out as a method of objective pathogenic detection for the follow-up of C.t urogenital infection.It is recommended that Roxithromycin be used to treat urogenital infection once a month after the end of treatment.

【Key words】 Chlamydia trachomatis； Urogenital infection； PCR-fluorescent probe method； Roxithromycin； Cure rate

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.31.013

目前我國性病監(jiān)測點(diǎn)生殖道沙眼衣原體（C.t）感染報(bào)告發(fā)病率高于全國梅毒和淋病，生殖道C.t感染已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題之一[1]。C.t感染可引起男性尿道炎、前列腺炎、附睪炎，女性陰道炎、前庭大腺炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、異位妊娠等[2]。重視對泌尿生殖道C.t感染疾病的防治，其中治療后隨訪是其防治過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。我國各大醫(yī)院開展的泌尿生殖道C.t感染隨訪的檢測手段眾多，包括核酸擴(kuò)增試驗(yàn)、直接免疫熒光抗體檢測、金標(biāo)法等，國內(nèi)性病指南中推薦羅紅霉素治療C.t感染療程結(jié)束后進(jìn)行隨訪[3]，但指南中未明確推薦治療后隨訪的檢測手段及隨訪次數(shù)，筆者回顧性分析贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2013年

1月-2017年12月診治的泌尿生殖道C.t感染354例患者的臨床資料，分析PCR-熒光探針法在羅紅霉素治療泌尿生殖道C.t感染患者隨訪判愈中的作用，以期建立較為客觀的治療后隨訪判愈標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2013年1月-2017年12月在贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診確診為C.t生殖道感染354例患者的臨床資料，采用羅紅霉素治療C.t感染并完成2次隨訪，其中男236例，女

118例；年齡18～60歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均已年滿18周歲；均符合C.t泌尿生殖道感染臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；男性有不同程度尿道炎癥狀，女性有陰道分泌物異常伴或不伴尿道刺激癥狀，熒光PCR-探針法檢測均已有生殖道C.t感染；患者或配偶有非婚性關(guān)系，且淋菌、支原體、白念珠菌檢測均陰性；近2周內(nèi)均未用過抗生素及隨訪期間未再有非婚性接觸史。排除標(biāo)準(zhǔn)：懷孕及哺乳期婦女；有嚴(yán)重心、肝、腎等內(nèi)臟疾病；惡性腫瘤；系統(tǒng)應(yīng)用免疫抑制劑；放、化療；治療期間又有性接觸；由于藥物不良反應(yīng)等各種原因未完成療程，中途停藥或換藥。所有患者均知曉本次研究并簽署知情同意書，該研究已經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 取材與檢驗(yàn) 男性取材，男性尿道標(biāo)本在排尿后1 h取材，尿道拭子插入尿道內(nèi)2～3 cm處，旋轉(zhuǎn)并停留10 s后拔出；女性取材：避開生理期，窺陰器暴露宮頸，先用一個(gè)棉拭子擦去過多的黏液，以另一個(gè)拭子插入宮頸管內(nèi)口1～2 cm并轉(zhuǎn)動(dòng)拭子5～10 s，慢慢拔出，避免觸及陰道壁，取材后采取C.t核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）進(jìn)行檢測。

1.2.2 藥物與治療 羅紅霉素（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H10970292，150 mg×12粒/盒）150 mg/次，2次/d，口服10 d。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) 比較根據(jù)病原學(xué)判愈標(biāo)準(zhǔn)和臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算的治愈情況。病原學(xué)判愈標(biāo)準(zhǔn)：療程結(jié)束后1、2個(gè)月均采用PCR-熒光探針法檢測，結(jié)果陰性為治愈；臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)：患者自覺癥狀消失，男性無尿道分泌物和尿痛，女性白帶異常消失，宮頸炎和尿道炎癥狀消退判定為治愈。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

根據(jù)臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)，354例患者中治愈283例，治愈率為79.94%；而第1、2次PCR-熒光探針法檢測的治愈率分別為73.45%和72.32%。臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)的治愈率均明顯高于第1、2次PCR-熒光探針法判愈標(biāo)準(zhǔn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.37、6.07，P=0.04、0.01）；但兩次PCR-熒光探針法判愈標(biāo)準(zhǔn)的治愈率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.18，P=0.67）。見表1。

3 討論

C.t泌尿生殖道感染常可表現(xiàn)為無癥狀或者隱匿感染，雖然沒有癥狀，但是C.t并未完全被清除，在適當(dāng)條件下，仍可以致病。有文獻(xiàn)報(bào)道85%女性和40%男性生殖道C.t感染者無癥狀，反復(fù)長期的感染在男性容易導(dǎo)致前列腺炎、附睪炎、不育癥、直腸炎等并發(fā)癥，女性易出現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎、附件炎、輸卵管妊娠、不孕以及盆腔炎等，此外，C.t感染的年輕患者治療后檢測再陽性的可能性比其他年齡段高，這種情況可增加患者各種C.t并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，因此對患者治療后的隨訪監(jiān)測十分重要。C.t治療后的隨訪中重要的環(huán)節(jié)之一為患者臨床癥狀緩解情況以及病原體檢測情況。目前國內(nèi)外泌尿生殖道C.t感染的治愈標(biāo)準(zhǔn)有所不同，美國判斷泌尿生殖道C.t感染治愈的標(biāo)準(zhǔn)為癥狀消失；在療程結(jié)束后不短于3周時(shí)進(jìn)行C.t DNA擴(kuò)增試驗(yàn)陰性[4]，而國內(nèi)生殖道C.t感染的判愈標(biāo)準(zhǔn)為：患者經(jīng)過規(guī)范治療結(jié)束

1周后，自覺癥狀消失，男性患者無尿道分泌物及尿痛，尿沉渣無白細(xì)胞，女性患者白帶異常癥狀及宮頸炎，尿道炎癥狀消失，在治療后隨訪中，一般不建議細(xì)菌性復(fù)查。細(xì)菌學(xué)隨訪的指征包括：泌尿生殖道癥狀持續(xù)不退，可能存在治療順應(yīng)性欠佳者，疑似再感染，無癥狀感染，使用紅霉素治療者[3]，可以看出國內(nèi)雖推薦對紅霉素治療患者進(jìn)行細(xì)菌學(xué)隨訪，但并未明確細(xì)菌學(xué)隨訪應(yīng)采用的檢測方法以及隨訪次數(shù)。

目前病原體隨訪檢測包括衣原體培養(yǎng)、酶免疫分析法、核酸擴(kuò)增試驗(yàn)、直接免疫熒光試驗(yàn)、乳膠免疫擴(kuò)散（金標(biāo)層析法）等。細(xì)胞培養(yǎng)法是診斷生殖道衣原體感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其敏感性低，標(biāo)本要求高，操作繁瑣以及培養(yǎng)周期長等缺點(diǎn)，很難在臨床上開展[5]。筆者采用PCR-熒光探針法進(jìn)行C.t感染診斷和隨訪的檢測，因?yàn)槊绹?015年性傳播疾病診療指南中核酸擴(kuò)增試驗(yàn)是C.t的診斷唯一提到的方法，因其敏感性高，非常適用于無癥狀攜帶或者輕癥患者的診斷，核酸被認(rèn)為是檢測C.t感染的擴(kuò)大的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]，臨床檢驗(yàn)方法將以核酸檢驗(yàn)為主[6]。此外，趙樂然等[7]認(rèn)為在敏感性、特異性、陽性預(yù)測率、陰性預(yù)測率方面，PCR法均較膠體金法有明顯的優(yōu)勢。熒光定量PCR是現(xiàn)階段在病原體載量檢測分析中廣泛應(yīng)用的方法，在C.t感染檢測中所具有的優(yōu)勢明顯[8]。PCR檢測技術(shù)在C.t泌尿生殖道感染的早期診斷中有非常重要的應(yīng)用前景，可以為其監(jiān)測提供依據(jù)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用一對沙眼衣原體特異性引物和一條沙眼衣原體特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體等成分，用PCR體外擴(kuò)增法檢測沙眼衣原體DNA。

羅紅霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能與細(xì)菌核蛋白體的50s亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽作用和mRNA的移位，從而阻礙了細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成而起到抑菌的作用，其體外抗菌作用與紅霉素類似，對衣原體的抗微生物作用與紅霉素相仿。羅紅霉素150 mg/次，2次/d口服，療程為10 d，是治療泌尿生殖道C.t感染的替代方案，近幾年發(fā)現(xiàn)使用抗生素治療泌尿生殖道C.t感染治療效果不盡如人意，經(jīng)過3次病原學(xué)隨訪的3大類抗生素治療C.t的治愈率不足70%[10]。楊麗娜等[11]報(bào)道對52例臨床株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，共發(fā)現(xiàn)13株紅霉素耐藥菌株。此外還發(fā)現(xiàn)從臨床分離的許多C.t菌株體外藥敏試驗(yàn)顯示對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥[12]。陳立新等[13]發(fā)現(xiàn)未用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿奇霉素患者藥物的MIC值均低于用藥后培養(yǎng)組，盧大喬等[14]通過對1 344例泌尿生殖道炎癥患者檢測沙眼衣原體結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體對羅紅霉素耐藥率較高，因此，對使用羅紅霉素治療泌尿生殖道感染的患者進(jìn)行治療后隨訪十分必要。在體外試驗(yàn)中，紅霉素具有誘導(dǎo)C.t持續(xù)感染的作用[15]，處于持續(xù)感染狀態(tài)的衣原體雖然不能感染細(xì)胞，但在細(xì)胞培養(yǎng)液中仍然有代謝活性，在去除有關(guān)因素后，又可以恢復(fù)到感染狀態(tài)；在臨床上，部分患者經(jīng)過羅紅霉素治療后可誘導(dǎo)C.t進(jìn)入持續(xù)感染狀態(tài)，感染癥狀消失，但核酸檢測可檢測到低載量的C.t感染[16]，所以口服羅紅霉素患者在治療后可能出現(xiàn)無癥狀但病原學(xué)檢測仍然為陽性，這可導(dǎo)致以臨床學(xué)癥狀為判愈標(biāo)準(zhǔn)高估治愈率。另外，單采用臨床癥狀消退與否來判定泌尿生殖道C.t感染是否治愈，則可能由于部分感染輕微患者癥狀不明顯而導(dǎo)致遺漏，從而導(dǎo)致患者轉(zhuǎn)為慢性感染出現(xiàn)諸多并發(fā)癥。

臨床上，筆者發(fā)現(xiàn)部分患者癥狀持續(xù)存在，可能是由于針對C.t熱休克蛋白表位出現(xiàn)了自身免疫病理反應(yīng)，局部組織慢性炎癥反應(yīng)和纖維化而出現(xiàn)前列腺炎、附睪炎、子宮內(nèi)膜炎、附件炎、盆腔炎等并發(fā)癥[17]，治療失敗患者首次傳代培養(yǎng)未見包涵體，但熱休克蛋白60含量增加，也提示C.t可能處于一個(gè)持續(xù)感染狀態(tài)[18]，加之患者精神緊張，部分患者出現(xiàn)心理問題而自訴臨床癥狀持續(xù)存在；沙眼衣原體感染后患者的自覺癥狀與患者的血清型、性別、年齡等各種因素有關(guān)；臨床上癥狀持續(xù)但無再感染的患者，而熒光PCR檢測陰性，也可能合并其他原因?qū)е碌拿谀蛏车栏腥拘约膊?，如患者衣原體感染的慢性尿道炎癥狀與慢性前列腺炎的癥狀可能類似，或者患者感染了其他病原體（如支原體、生殖器皰疹等），應(yīng)對患者對可能的其他病原體行詳細(xì)多次的檢測，排除其他感染性疾病的可能性，避免誤診[19]，因此，單采用臨床癥狀消退與否來判定泌尿生殖道C.t感染是否治愈該標(biāo)準(zhǔn)不夠客觀，熒光PCR檢測具有高度的敏感性和特異性，其出現(xiàn)假陽性概率小，可推薦其作為患者治療后隨訪的重要檢測手段。

邵麗麗等[20]發(fā)現(xiàn)在924例泌尿生殖道C.t感染中，臨床學(xué)判愈率顯著高于第1、2、3次病原學(xué)判愈率且第1次病原學(xué)判愈率顯著高于第2次；第2次與第3次比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。推薦治療后復(fù)查2次很有必要，而不推薦做第3次復(fù)查，筆者采用治療后病原學(xué)隨訪2次的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)臨床判愈標(biāo)準(zhǔn)的治愈率均明顯高于第1、2次PCR-熒光探針法判愈標(biāo)準(zhǔn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.37、6.07，P=0.04、0.01）；但兩次PCR-熒光探針法判愈標(biāo)準(zhǔn)的治愈率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.18，P=0.67）。其原因可能是筆者采用的PCR-熒光探針法敏感性（敏感性>95%）較直接免疫熒光法（敏感性為70%～90%）高，直接免疫熒光法對檢測者經(jīng)驗(yàn)要求高，檢驗(yàn)結(jié)果客觀性、穩(wěn)定性不如PCR法，這可能是采用直接免疫熒光法第1次病原學(xué)判愈率與第2次病原學(xué)判愈率出現(xiàn)差別的原因。筆者通過隨訪患者，發(fā)現(xiàn)兩次采用熒光PCR病原學(xué)檢測判愈率無區(qū)別。綜上所述，由于羅紅霉素易誘導(dǎo)C.t感染出現(xiàn)耐藥菌株，治愈率不盡如人意，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)加強(qiáng)對羅紅霉素治療C.t感染的治療效果隨訪，推薦可在療程結(jié)束后進(jìn)行1次熒光PCR病原學(xué)檢測結(jié)合臨床癥狀是否消失以判斷患者是否治愈。

參考文獻(xiàn)

[1]岳曉麗，龔向東，滕菲，等.2008-2015年中國性病監(jiān)測點(diǎn)生殖道沙眼衣原體感染流行特征分析[J].中華皮膚科雜志，2016，49（5）：308-313.

[2] Mendes N，Palma F，Serrano F.Sexual and reproductive health of Portuguese adolescents[J].Int J Adolesc Med Health，2014，26（1）：3-12.

[3]中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心.梅毒、淋病、生殖器皰疹、生殖道沙眼衣原體感染診療指南（2014）[J].中華皮膚科雜志，2014，47（5）：365-372.

[4] Workowski K A，Bolan G A.Sexually transmitted diseases treatment guidelines，2015[J].MMWR Recomm Rep，2015，64（RR3）：1-137.

[5]劉志超，劉原君，馮斌，等.四種檢測泌尿生殖道沙眼衣原體方法的比較與評價(jià)[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，25（8）：641-643.

[6]劉全忠.泌尿生殖道沙眼衣原體感染展望[J].中國醫(yī)學(xué)文摘：皮膚科學(xué)，2016，33（3）：349-354.

[7]趙樂然，劉原君，王敬，等.兩種方法檢測泌尿生殖道沙眼衣原體的比較[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2014，28（11）：1178-1183.

[8]趙紅英，趙縝，曹國君，等.沙眼衣原體熒光PCR法在陰道炎患者實(shí)驗(yàn)室檢測中的效果評價(jià)[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2017，31（7）：809-811.

[9]劉原君，王千秋.沙眼衣原體感染的診斷與實(shí)驗(yàn)室檢查現(xiàn)狀[J].中國醫(yī)學(xué)文摘：皮膚科學(xué)，2016，33（3）：316-321.

[10]齊蔓莉，張楠，劉全忠.六種抗菌藥物治療非淋菌性尿道（宮頸）炎的療效分析[J].中華皮膚科雜志，2005，38（5）：313-314.

[11]楊麗娜，江勇，劉全忠.泌尿生殖道沙眼衣原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的體外藥敏研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2010，9（5）：298-299.

[12] Jiang Y，Zhu H，Yang L N，et al.Differences in 23S ribosomal RNA mutations between wild-type and mutant macrolide-resistant Chlamydia trachomatis isolates[J].Experimental & Therapeutic Medicine，2015，10（3）：1189-1193.

[13]陳立新，王蕊，尤聰，等.抗菌藥物對泌尿生殖道沙眼衣原體臨床株培養(yǎng)的影響[J].中華皮膚科雜志，2013，46（5）：317-319.

[14]盧大喬，熊冰，周長春，等.泌尿生殖道性病感染病原體分布與耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（2）：363-365.

[15] Beatty W L，Morrison R P，Byrne G I.Reactivation of persistent Chlamydia trachomatis infection in cell culture[J].Infection & Immunity，1995，63（1）：199-205.

[16]黃凱凱，劉雋華，韓建德.沙眼衣原體生殖道持續(xù)性感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和治療進(jìn)展[J].國際皮膚性病學(xué)雜志，2017，43（1）：54-57.

[17] Jha R，Vardhan H，Bas S，et al.Chlamydia trachomatis heat shock proteins 60 and 10 induce apoptosis in endocervical epithelial cells[J].Inflammation Research，2011，60（1）：69-78.

[18]尤聰，劉原君，姚衛(wèi)鋒，等.E型沙眼衣原體臨床株熱休克蛋白60含量變化及傳代衣原體培養(yǎng)與療效的關(guān)系[J].中華皮膚科雜志，2012，45（5）：352-354.

[19]程浩.泌尿生殖道沙眼衣原體感染的判愈、隨訪、預(yù)后與預(yù)防[J].中國醫(yī)學(xué)文摘：皮膚科學(xué)，2016，33（3）：344-348.

[20]邵麗麗，展小飛，齊蔓莉，等.米諾環(huán)素治療沙眼衣原體泌尿生殖道感染臨床判愈與病原學(xué)判愈的比較[J].中華皮膚科雜志，2016，49（12）：885-888.

（收稿日期：2018-08-03） （本文編輯：李瑩瑩）