卡拉膠酶固體酶制劑的噴霧干燥制備工藝優(yōu)化

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(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021; 2.綠新(福建)食品有限公司,福建漳州 363100; 3.福建省海洋功能食品工程技術研究中心,福建廈門 361021; 4.廈門市海洋功能食品重點實驗室,福建廈門 361021)

卡拉膠是以1,3-β-D半乳糖和1,4-α-D半乳糖作為基本骨架連接而成的線性硫酸多糖。卡拉膠因其優(yōu)良的理化性質及多種生物活性,在食品、醫(yī)藥、飼料和化工等領域具有重要的應用價值。相對卡拉膠而言,卡拉膠寡糖分子量較小、溶解性較好、穩(wěn)定性和安全性都有所改善。研究發(fā)現(xiàn),卡拉膠降解得到的小分子寡糖具有免疫[1-2]、抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5]和抗病毒[6-7]活性等。

通過物理法、化學法和酶解法降解卡拉膠可以制備卡拉膠寡糖[8-10]。相對于化學法和物理法降解,酶法降解反應條件溫和,易于控制,可以最大程度地保護反應底物的活性基團不會在降解過程中受到破壞,產物活性較高。除此之外,卡拉膠酶可特異性地斷裂卡拉膠的β-1,4-糖苷鍵,生成卡拉膠寡糖,降解產物均一。酶解過程中酸堿用量少,對環(huán)境污染少,表現(xiàn)出了較好的應用前景。目前,卡拉膠酶的研究主要集中在產酶菌種篩選[11-12]、發(fā)酵特性[13-14]和酶學性質[15-16]研究等方面。

為了實現(xiàn)卡拉膠酶的推廣應用,需要將卡拉膠酶制備成固體酶制劑,從而便于卡拉膠酶的貯藏和運輸。目前,固體酶制劑的制備方法主要有冷凍干燥[17-18]、噴霧干燥[19-20]和真空干燥[21]等。其中,噴霧干燥法具有操作簡單、干燥速度快、干燥產品狀態(tài)均一、參數(shù)可控性強等優(yōu)點,從而在工業(yè)生產中被廣泛用于各種液態(tài)物料,如糖類、脂類、氨基酸、維生素、色素、酶蛋白等的干燥。

噴霧干燥法已經在單寧酶[19]、柚苷酶[20]、溶菌酶[22]等固體酶制劑的制備過程中得到應用,而卡拉膠酶固體酶制劑的制備工藝尚未見報道。本研究通過單因素實驗建立了噴霧干燥工藝參數(shù),并在單因素實驗基礎上,采用響應面分析法,對影響卡拉膠酶酶制劑噴霧干燥的顯著因子——麥芽糊精含量、進料速度和進風溫度進行考察,建立卡拉膠酶固體酶制劑的噴霧干燥工藝的二次多項數(shù)學模型,進而確定噴霧干燥制備卡拉膠固體酶制劑的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳糖 上海國藥集團;牛肉浸膏 上海中科新生命生物科技有限公司;胰蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司;卡拉膠 綠新(福建)食品有限公司;麥芽糊精 食品級,北京索萊寶科技有限公司;脫脂奶粉 伊利集團有限公司;菌種PseudoalteromonascarrageenovoraASY5 分離自廈門紅樹林土壤腐葉樣品,保藏于中國工業(yè)微生物保藏管理中心(CICC),保藏編號為23819。NaCl 西隴化工股份有限公司;KCl 西隴化工股份有限公司;CaCl2西隴化工股份有限公司;MgCl2·6H2O 國藥集團化學實劑有限公司;NaHCO3西隴化工股份有限公司;MgSO4·7H2O 國藥集團化學實劑有限公司;FeSO4·7H2O 國藥集團化學實劑有限公司;NaH2PO4·2H2O 西隴化工股份有限公司;Na2HPO4·12H2O 西隴科學股份有限公司;蔗糖 國藥集團化學實劑有限公司;以上試劑均為分析純。

Unic7200型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;FE20/EL20 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BS233S電子天平 德國賽多利科學儀器(北京)有限公司;WB-10L1精密恒溫水浴鍋 廈門精藝興業(yè)科技有限公司;Thermo scientific層析柜 Thermo Fisher Scientific Inc;GZX-DH電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;YC-1000實驗室噴霧制粒包衣機 上海雅程儀器設備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、蒸餾水250 mL、人工海水(人工海水:NaCl 37.51 g、KCl 1.03 g、CaCl21.61 g、MgCl2·6H2O 6.4 g、NaHCO30.15 g、MgSO4·7H2O 4.67 g、蒸餾水1000 mL)750 mL。牛肉浸膏和胰蛋白胨溶解后調pH至7.8,加熱煮沸10 min,冷卻后調pH至7.3,然后和人工海水混合,121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:卡拉膠2.5 g、NaCl 30 g、KCl 0.1 g、CaCl20.2 g、MgSO4·6H2O 3.0 g、胰蛋白胨3.0 g、FeSO4·7H2O 0.036 g、NaH2PO4·2H2O 1.3 g、Na2HPO4·12H2O 3.8 g、蒸餾水1000 mL,121 ℃、滅菌20 min。

1.3 卡拉膠酶粗酶液的制備

將保存在-20 ℃的菌種解凍后,接入制備好的種子培養(yǎng)基,在搖床溫度20 ℃、轉速180 r/min條件下培養(yǎng)24 h,即為活化的菌種。將活化好的種子液以2%的接種量接入制備好的發(fā)酵培養(yǎng)基,在搖床溫度20 ℃、轉速180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)32 h,發(fā)酵液在5000 r/min離心20 min,收集上清液,即為粗酶液,保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 卡拉膠酶固體酶制劑制備流程

粗酶液依次經過0.8、0.45、0.22 μm水相膜抽濾,向50 mL酶液中加入麥芽糊精,至終濃度為20%,溶解后,噴霧干燥制備卡拉膠酶固體制劑。噴霧干燥初始條件為:進風溫度130 ℃,熱風流量4 m3/min,進料速度400 mL/h,噴霧壓力0.15 MPa。

1.5 助干劑和保護劑的選擇

先選取麥芽糊精、脫脂奶粉、蔗糖為助干劑,其添加量為20%(質量與體積比),考察其對卡拉膠酶酶活回收率的影響;接著考察最優(yōu)助干劑的添加量對卡拉膠酶酶活回收率的影響。

選取甘油、吐溫80、NaCl、海藻糖作為保護劑,其添加量均為0.5%(體積或質量與體積比),考察其對卡拉膠酶酶活回收率的影響,對照組不添加保護劑。

1.6 單因素實驗設計

通過單因素實驗對影響卡拉膠酶活回收率的噴霧干燥條件進行優(yōu)化,包括進風溫度(110、120、130、140、150 ℃)、熱風流量(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 m3/min)、進料速度(300、400、500、600、700 mL/h)、噴霧壓力(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 MPa)。噴霧干燥初始條件為:進風溫度130 ℃,熱風流量4 m3/min,進料速度400 mL/h,噴霧壓力0.15 MPa。按照上述順序逐一進行優(yōu)化,并且在后續(xù)實驗中使用上一個最佳條件,進行三次平行實驗。

1.7 響應面實驗設計

在單因素實驗基礎上,以卡拉膠酶酶活回收率為響應指標,使用Box-Behnken中心組合實驗設計,采用3因素3水平進行響應面設計,對噴霧干燥條件進行優(yōu)化,實驗因素與水平設計見表1。

表1 Box-Bohnkon實驗設計因子及水平表Table 1 Factors and levels of response surface Box-Bohnkon design

1.8 卡拉膠酶活力測定

[23]，稱取0.1 g酶制劑,用緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4,pH7.0)充分溶解后定容至10 mL。采用3,5-二硝基水楊酸法[24]測定酶解產物還原糖的含量。在pH7.0,60 ℃條件下每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活單位(U/g)。

酶制劑的酶活回收率(%)=(酶制劑活力/加入酶液的活力)×100

酶制劑的相對活力(%)=(酶制劑活力值/該組中最高活力值)×100

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016制圖,SPSS 17.0對單因素實驗數(shù)據(jù)進行Duncan多重比較分析,Design Expert 8.0.6.1進行響應面實驗設計及數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 噴霧干燥中助干劑和保護劑的選擇

2.1.1 助干劑及用量的選擇 粗酶液中固形物含量較少,噴霧干燥后幾乎收集不到酶粉,因此在噴霧干燥中需添加助干劑以便得到酶粉。本實驗選取不同助干劑,考察其對酶活回收率的影響,結果如圖1所示。

圖1 助干劑對酶活回收率的影響Fig.1 Effects of drying aids on carrageenase activity recovery注:A:助干劑對酶活回收率的影響;B:麥芽糊精添加量對酶活回收率的影響；圖中不同字母表示差異顯著,p<0.05。

圖1A可以看出,以麥芽糊精為助干劑時,酶活回收率較高,達到40.8%,這是因為麥芽糊精的水溶性好,噴霧干燥過程中形成的霧滴均勻,能起到較好的包埋效果。除此之外,麥芽糊精的玻璃化轉變溫度(Tg)較大,能顯著提高干燥物料的Tg,使噴霧干燥的顆粒溫度低于其Tg,防止物料進入黏流態(tài)[25],使其在干燥過程中較少出現(xiàn)黏壁現(xiàn)象,干燥成粉效果好。而以脫脂奶粉和蔗糖為助干劑時,酶活回收率相對較低。實驗中發(fā)現(xiàn),在以脫脂奶粉為助干劑時,噴霧干燥過程中會堵塞噴霧頭,導致收集到的酶粉較少,從而降低了酶活回收率,而以蔗糖為助干劑時,同樣會收集到較少的酶粉,并且得到的酶制劑有結塊現(xiàn)象。因此最適的助干劑為麥芽糊精。

圖1B為麥芽糊精的添加量對酶制劑酶活回收率的影響。隨著麥芽糊精濃度的增加,酶活力有降低的趨勢,而酶活回收率則先增加然后基本保持不變,這是因為隨著麥芽糊精添加量的增加,增大了料液形成霧滴的表面積,使得水分更容易逸出,從而減少了噴霧干燥時的掛壁現(xiàn)象,使得更容易收集到酶粉。但添加量過大,又會引起輸送和霧化困難,造成霧化器噴嘴堵塞,不利于成粉,降低單位質量的酶粉的活力。在麥芽糊精的添加量為25%時,酶活力和酶活回收率都較高,回收率達到47.9%,因此選擇添加25%麥芽糊精。

2.1.2 保護劑的選擇 在噴霧干燥過程中,有時會添加保護劑用于保護酶在高溫下不會變性失活。多羥基類化合物是噴霧干燥中常用的保護劑,它能代替水分子與蛋白質形成氫鍵,在水分子缺失的情況下保持蛋白的結構穩(wěn)定[26]。

由圖2結果可知,添加甘油、吐溫80和NaCl三種保護劑,酶活回收率與不添加保護劑相比沒有顯著差異,而添加海藻糖后,酶活回收率有顯著下降,因此,選擇不添加保護劑進行卡拉膠酶酶制劑的噴霧干燥制備。

圖2 保護劑對酶活回收率的影響Fig.2 Effect of protective agent on carrageenase activity recovery注：圖中不同字母表示差異顯著,p<0.05。

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 進風溫度對酶活回收率的影響 進風溫度是影響酶活回收率和酶活力的一個重要因素。進風溫度過低,熱量供給較弱,脫水速率較慢,導致產品在干燥容器內部流動時由于顆粒表面水分含量高而黏性大,容易黏壁,隨著溫度升高,此現(xiàn)象減弱,但溫度過高又會導致產品熱熔黏壁[27]。因此本實驗考察進風溫度對卡拉膠酶酶制劑制備的影響,選擇最佳進風溫度,有利于減少酶活力的損失,同時節(jié)約能源。

如圖3所示,隨著進風溫度的升高,酶活力呈現(xiàn)降低的趨勢,這是因為進風溫度越高出風溫度也越高[28],致使蛋白長時間接觸高溫,活性變低。在110～130 ℃之間,酶活力下降,而酶活回收率基本保持不變,因為溫度的升高,有利于形成更多的酶粉,導致酶粉的收集率變大,從而酶活回收率基本維持不變。在130～150 ℃之間時,酶活回收率則呈現(xiàn)降低的趨勢,其中在130 ℃處,酶活回收率有峰值,為43.1%。因此進風溫度選擇130 ℃。

圖3 進風溫度對酶活回收率和相對酶活力的影響Fig.3 Effect of inlet air temperature on carrageenase activity recovery

2.2.2 熱風流量對酶活回收率的影響 熱風流量的高低能影響物料水分蒸發(fā)的快慢,同時會改變酶液和熱空氣的接觸時間及出風溫度。以熱風流量為研究對象,結果見圖4。

圖4 熱風流量對酶活回收率和相對酶活力的影響Fig.4 Effect of hot air flow rate on carrageenase activity recovery

隨著熱風流量的增加,酶活力呈現(xiàn)降低的趨勢,這是因為在噴霧干燥過程中,濕粉在旋風分離器中沉降,接受至少10 min出口溫度下的干燥處理[29],此過程中長時間的高溫作用可能導致蛋白質變性,溶解性降低,從而影響酶活力。酶活回收率則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,因為在一定范圍內,隨著熱風流量的增加,促使干燥塔的溫度提高,從而形成更多的酶粉,但溫度過高則使酶失活。當熱風流量為4.5 m3/min時,酶活回收率最大。

2.2.3 進料速度對酶活回收率的影響 圖5為進料速度對酶活回收率和相對酶活力的影響。隨著進料速度的增加,酶活力呈現(xiàn)增加的趨勢,而酶活回收率則呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,因為加快進料速度雖可以提高噴霧干燥的效率,但是速度過快,霧滴變大,超過霧化室的干燥能力,會導致水分蒸發(fā)不徹底,造成嚴重的掛壁現(xiàn)象[30],基本無法出粉,導致收集到的酶粉減少,故酶活回收率降低。在進料速度為300 mL/h,酶活力最低,這是因為過低的進料速度使干燥容器內部干燥產品顆粒濃度較低,慣性力不足,導致黏壁;除此之外,進料速度的過低致使酶液和熱風接觸時間過長,導致部分酶失活。進料速度為400 mL/h時,酶活回收率較優(yōu)。

圖5 進料速度對酶活回收率和相對酶活力的影響Fig.5 Effect of feeding speeds on carrageenase activity recovery

2.2.4 噴霧壓力對酶活回收率的影響 如圖6所示,隨著噴霧壓力升高,酶活力和酶活回收率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,因為噴霧壓力過低,酶液不能充分分散開,形成的液滴過大,不能被完全干燥或者部分沉降到干燥塔的壁上,同時增加了酶粉的水分含量,隨著噴霧壓力增高,物料分散均勻,利于干燥成粉,但是噴霧壓力過高又會有部分酶液粘到壁上。在噴霧壓力為0.2～0.25 MPa時,酶活回收率相對穩(wěn)定,其中在噴霧壓力為0.2 MPa時出現(xiàn)峰值,為50.5%。

圖6 噴霧壓力對酶活回收率和相對酶活力的影響Fig.6 Effect of spray pressure on carrageenase activity recovery

2.3 響應面實驗結果與分析

使用SPSS Statistics 17.0對影響卡拉膠酶酶活回收率的因素(麥芽糊精含量,進料速度,熱風流量,進風溫度及噴霧壓力)優(yōu)化結果進行方差分析。其中麥芽糊精含量(p=0.03),進料速度(p=0.03),進風溫度(p=0.021)對結果影響顯著。故本實驗在熱風流量為4.5 m3/h和噴霧壓力為0.2 MPa條件下,選取麥芽糊精含量、進料速度和進風溫度為實驗因素,以卡拉膠酶酶活回收率為響應指標進行響應面設計,實驗方案及實驗結果見表2。

表2 Box-Bohnkon實驗設計表及結果Table 2 Designs and results of Box-Bohnkon experiment

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 以實驗所得卡拉膠酶酶活回收率為響應值(Y),采用Design-Expert 8.0.6.1程序進行回歸擬合后,得到卡拉膠酶酶活回收率對麥芽糊精含量(A)、進料速度(B)、進風溫度(C)編碼值的二次多項回歸方程為:

Y=53.47+5.31A+4.25B-5.37C-1.36AB-0.14AC+2.38BC-7.80A2-2.85B2-7.99C2

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

注：*,差異顯著,p<0.05;**,差異極顯著,p<0.01。

對該模型進行方差分析,模型p<0.01,表明回歸模型極顯著。失擬項p=0.2402>0.05,模型失擬度不顯著,回歸模型擬合度較好。相關系數(shù)R2=98.48%,說明98.48%的實驗數(shù)據(jù)可由此方程解釋,實驗誤差小。模型一次項A、B、C(p<0.01)影響極顯著;二次項A2、C2(p<0.01)影響極顯著,B2(p<0.05)影響顯著;交互項BC(p<0.05)影響顯著,AB、AC(p>0.05)影響不顯著。由一次項系數(shù)絕對值的大小可以判斷出各因素對響應值Y影響的大小順序為:C>A>B,即進風溫度>麥芽糊精含量>進料速度。

2.3.2 卡拉膠酶噴霧干燥的響應面分析及優(yōu)化 圖7為進風溫度位于中心水平即135 ℃時,麥芽糊精含量、進料速度及其交互作用對卡拉膠酶活回收率影響的響應面和等高線圖。圖7中等高線圖接近圓形表明兩者交互作用不顯著,卡拉膠酶的回收率在麥芽糊精含量25%～27.5%和進料速度450～500 mL/h范圍內有最大值。從響應面圖可以看出,卡拉膠酶回收率隨麥芽糊精含量的改變而呈現(xiàn)出的變化趨勢遠大于進料速度,因此麥芽糊精含量對卡拉膠酶回收率的影響大于進料速度。

圖7 麥芽糊精含量、進料速度及其交互作用對卡拉膠酶酶活回收率影響的響應面和等高圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of maltodextrin content and feeding speeds on carrageenase activity recovery

從圖8可以看出,麥芽糊精含量和進風溫度交互作用不顯著。從響應面圖中可以看出,麥芽糊精含量對卡拉膠酶活回收率的影響大于進風溫度。由圖8等高線圖可知,卡拉膠酶的回收率在麥芽糊精含量25%～27.5%和進風溫度在127.5～135 ℃范圍內有最大值。

圖8 麥芽糊精含量、進風溫度及其交互作用對卡拉膠酶酶活回收率影響的響應面和等高圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of maltodextrin content and cross-interation inlet air temperature on carrageenase activity recovery

從圖9響應面圖中可以看出,當固定進料速度為某一值時,進風溫度在120～135 ℃范圍內,酶活回收率隨進風溫度增大而增大,當進風溫度超過135 ℃后,卡拉膠酶的酶活回收率隨進風溫度的增加而降低;當固定進風溫度為某一值時,酶活回收率隨著進料速度的變化也是先增加后降低,這與單因素優(yōu)化結果是相符的。由圖9中的等高線圖可知,卡拉膠酶的酶活回收率在進料速度450～500 mL/h和進風溫度127.5～135 ℃范圍內有最大值。

圖9 進料速度、進風溫度及其交互作用對卡拉膠酶酶活回收率影響的響應面和等高圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of feeding speeds and cross-interation inlet air temperature on carrageenase activity recovery

2.3.3 驗證實驗 利用軟件Design-Expert 8.0對方程模型進行分析,得到制備卡拉膠酶酶制劑的最佳參數(shù)條件為麥芽糊精含量為26.5%,進料速度為456.9 mL/h,進風溫度為131.2 ℃,在此條件下,預測卡拉膠酶酶制劑的酶活回收率達到56.1%。修正后選擇麥芽糊精含量為27%,進料速度為456 mL/h,進風溫度為131 ℃。在此條件下進行3次重復實驗,得到卡拉膠酶酶制劑的酶活回收率為56.9%±2.1%,與理論值的誤差為1.3%,表明所得模型能反映出各因素對卡拉膠酶酶制劑的酶活回收率的影響。

3 結論

為優(yōu)化卡拉膠固體酶制劑噴霧干燥制備工藝,本實驗通過單因素和Box-Behnken對工藝條件進行優(yōu)化。在單因素實驗基礎上,采用Box-Behnken設計,以卡拉膠酶酶活回收率為評價指標對噴霧干燥法制備卡拉膠酶固體酶制劑的工藝進行優(yōu)化,最終得到噴霧干燥最佳參數(shù)條件為:麥芽糊精濃度27%,進風溫度131 ℃,熱風流量4.5 m3/min,進料速度456 mL/h,噴霧壓力0.2 MPa。在此條件下,酶活回收率達到56.9%±2.1%。

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