主成分分析和聚類分析法研究刺玫果黃酮類成分HPLC指紋圖譜

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(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院,山西太原 030006)

表1 刺玫果樣品信息Table 1 Sample informations of Rosa davurica

刺玫果為薔薇科薔薇屬植物刺玫的成熟果實,又名薔薇果、刺莓果,分山刺玫(RosadavuricaPall.)和黃刺玫(RosaxanthinaLindl.)兩種,廣泛分布于山西、河北、東北和內(nèi)蒙古等[1]。山西省以黃刺玫為主,主要分布在呂梁山脈、太行山脈、五臺山、中條山等山區(qū),資源豐富、產(chǎn)量高,是一種經(jīng)濟(jì)價值高、食藥同源的野生果類,民間大量采食用于泡茶、泡酒等[2]?！吨兴幋筠o典》記載其有健脾理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的作用[3]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),刺玫果含有豐富的維生素、氨基酸、黃酮、皂苷和植物超氧化物歧化酶(SOD)等活性成分[4],具有預(yù)防心血管病變和抗衰老的作用,其中黃酮類物質(zhì)對高血脂和抗氧化療效顯著。目前,以野生刺玫果為主要原料的食品、保健品和功能性飲料日益受到重視并廣泛開發(fā)[5]。

近年來指紋圖譜技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用,但是僅以相似度并不能對中藥質(zhì)量做出較全面的評價?；瘜W(xué)模式識別技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)所含化學(xué)成分的信息,利用計算機(jī)對其進(jìn)行分類或描述的方法,能夠較好的滿足復(fù)雜化學(xué)成分信息的模糊性和整體性的要求[6-7]。目前化學(xué)模式識別技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品和藥品的分類和質(zhì)量評價,尤其以主成分分析和聚類分析居多,如馬赟[8]等人應(yīng)用聚類分析和主成分分析對甜味絞股藍(lán)黃酮類成分進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其成分差異與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境、采集加工方法等因素有關(guān);Dongnan Li[9]等人采用液相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合主成分分析對藍(lán)莓中花色苷成分進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)地域差異是影響藍(lán)莓中花色苷成分的主要因素。目前雖有文獻(xiàn)對刺玫果指紋圖譜進(jìn)行了探討[10-11],但僅以相似度為評價指標(biāo),并未對其品種進(jìn)行分類,也未對共有特征峰進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,信息量非常有限。本研究采用高效液相色譜法(HPLC)建立了以刺玫果黃酮類成分為基礎(chǔ)的指紋圖譜,考察了30批不同產(chǎn)地、不同品種刺玫果的相似度,并基于指紋圖譜信息綜合運(yùn)用主成分分析(Principal component analysis,PCA)和系統(tǒng)聚類分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)進(jìn)行化學(xué)模式識別研究,為刺玫果的品種鑒別和質(zhì)量評價提供較全面的評價方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺玫果樣品 共30批樣品信息見表1(其中S1和S13為人工栽培,其余均為野生),樣品經(jīng)山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院王曉燕高級工程師分別鑒定為薔薇科植物:黃刺玫(RosaxanthinaLindl.)和山刺玫(RosadavuricaPall.);蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號100080-201409;金絲桃苷對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號:111521-201004;槲皮素對照品 成都普思生物科技股份有限公司,批號PS0605-0025;乙腈 色譜純,西隴化工有限公司;磷酸、95%乙醇 分析純，天津登豐化學(xué)品公司;超純水自制。

Agilent 1200型高效液相色譜儀(配DAD檢測器) 美國安捷倫科技公司;AB104.N 型分析天平 上海托利-梅特勒儀器有限公司;UPHW-I-90T型優(yōu)普系列超純水系統(tǒng) 成都超純科技有限公司;XA-1型多功能粉碎機(jī) 山東省青州市益康中藥機(jī)械有限公司;MH-500電子調(diào)溫電熱套 北京科偉儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品蘆丁2.0 mg、金絲桃苷2.0 mg和槲皮素1.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配成濃度分別為0.2、0.2和0.1 g/L的混合對照品貯備液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,進(jìn)HPLC分析。

1.2.2 供試品溶液的制備 取適量刺玫果適當(dāng)粉碎,精密稱取粗粉10.0 g,置于圓底燒瓶中,加入70%的乙醇溶液100 mL,回流提取1 h,過濾,取續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,作為供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 安譜Athena-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:360 nm;進(jìn)樣量:20 μL。流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫程序:0～10 min,12%～16% A;10～26 min,16%～16% A;26～44 min,16%～28% A;44～53 min,28%～30% A;53～58 min,30%～35% A;58～60 min,35%～12% A。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度實驗 取刺玫果粗粉10.0 g,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定,記錄指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.4.2 重復(fù)性實驗 稱取同一批刺玫果粗粉6份,每份10.0 g,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定,記錄指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液分別于制備后 0、4、8、12、18、24 h,按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定,記錄指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.4.4 加樣回收率實驗 取已知蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的刺玫果粗粉6份,每份10.0 g,置于圓底燒瓶中,加入70%的乙醇溶液99 mL,同時加入混合對照品溶液1 mL(相當(dāng)于提取液中含蘆丁2.0 mg/L、金絲桃苷2.0 mg/L和槲皮素1.0 mg/L),按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定,計算蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的加樣回收率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件以不同品種產(chǎn)地刺玫果共有峰的峰面積為初始數(shù)據(jù),經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后以主成分的方差貢獻(xiàn)率和特征值為依據(jù),進(jìn)行主成分分析;采用SPSS 22.0 軟件對共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,采用組間連接法、歐氏距離平方作為樣品測度,對不同品種產(chǎn)地的刺玫果的共有峰進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件考察

實驗初期考察了不同的流動相系統(tǒng),包括甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%乙酸和乙腈-0.2%甲酸。有報道[12]采用甲醇-乙腈-四氫呋喃-0.5%醋酸系統(tǒng),由于四氫呋喃會對儀器管路造成一定的腐蝕,因此沒有考慮此系統(tǒng)。結(jié)果表明乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)的各色譜峰分離情況和峰形均較好。根據(jù)3D全波長掃描圖譜,選擇性考察了210、254、270 和360 nm波長下的色譜圖,結(jié)果表明波長為360 nm時基線較穩(wěn),色譜峰較多且分離效果良好,因此選擇360 nm為檢測波長。

2.2 方法學(xué)考察

精密度實驗結(jié)果相似度大于0.99,各共有峰的相對保留時間RSD小于0.9%,相對峰面積RSD小于2.9%;重復(fù)性實驗結(jié)果相似度大于0.99,各共有峰的相對保留時間RSD小于1.0%,相對峰面積RSD小于4.1%;穩(wěn)定性實驗結(jié)果相似度大于0.99,各共有峰的相對保留時間RSD小于1.0%,相對峰面積RSD小于4.9%;加樣回收率實驗結(jié)果顯示,蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的加樣回收率分別為97.3%±1.2%,96.2%±1.9%和98.2%±1.1%,RSD分別為3.2%、2.4%和2.6%。結(jié)果表明儀器精密度良好,方法重復(fù)性、準(zhǔn)確度良好,供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜的要求。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

分別取30批刺玫果樣品,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,另取混合對照品溶液20 μL,按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定,記錄樣品和對照品的色譜圖。樣品譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》軟件,剪切前5 min溶劑峰后,采用多點校正進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配,選用均值法生成刺玫果共有模式的對照指紋圖譜(R),結(jié)果見圖1、圖2。由于刺玫果中大部分化學(xué)成分尚且未知且實驗條件有限,未能對其共有峰進(jìn)行定性研究,通過與已有標(biāo)準(zhǔn)品對照得知,圖2中5號峰為蘆丁,7號峰為金絲桃苷,13號峰為槲皮素。

表2 30批刺玫果中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量測定結(jié)果(μg/g)Table 2 Determination results of rutin,hyperoside and quercetin in 30 batches of Rosa davurica(μg/g)

圖1 混合對照品的色譜圖Fig.1 The chromatogram of hybrid reference substance注:1.蘆丁;2.金絲桃苷;3.槲皮素。

圖2 刺玫果樣品的對照圖譜Fig.2 The reference fingerprint chromatogram of Rosa davurica samples

2.4 含量測定結(jié)果

刺玫果中黃酮類成分蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量測定結(jié)果見表2。由結(jié)果可見,刺玫果中蘆丁的含量參差不齊,較高值在60.56～69.51 μg/g之間,包括S1、S19和S22,這3批樣品分別來自山西省的太原市、臨汾市和呂梁市,其中蘆丁含量最高的樣品為冷凍鮮果;山刺玫果中金絲桃苷的含量遠(yuǎn)高于黃刺玫果,是黃刺玫果的幾十倍甚至上百倍,而槲皮素的含量也普遍高于黃刺玫果,這2種成分含量最高的樣品來自黑龍江加格達(dá)奇。由此可見,黃刺玫果與山刺玫果的黃酮類成分在含量上存在一定的差異。

表3 刺玫果樣品的相似度評價結(jié)果Table 3 Similarity evaluation results of rose fruits

2.5 指紋圖譜相似度評價

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)分析得到30批刺玫果樣品的相似度結(jié)果,并確定了15個共有峰。圖3為30批樣品匹配后的色譜圖,相似度計算結(jié)果見表3。根據(jù)相似度結(jié)果可將30批刺玫果大致分為2類:第1類相似度在0.95～1.00之間,包括S1～S22,均為黃刺玫果,此類樣品的產(chǎn)地主要為山西省、河北省和陜西省;第2類相似度在0.77～0.94之間,包括S23～S30,該樣品均為山刺玫果,產(chǎn)地分別為黑龍江省、吉林省、遼寧省和內(nèi)蒙古地區(qū)。由上述結(jié)果可見,不同品種刺玫果之間化學(xué)成分存在較大的差異,而不同產(chǎn)地和不同年份之間差異較小。

圖3 30批刺玫果樣品匹配后的色譜圖Fig.3 The matched chromatogram of 30 batches of Rosa davurica samples

表4 共有峰的相對峰面積Table 4 Relative peak areas of common peaks

2.6 主成分分析

主成分分析(PCA)是在盡可能保留原有信息的基礎(chǔ)上,將高維數(shù)空間的信息映射到低維數(shù)的幾個主成分上,使數(shù)據(jù)簡化,降低維數(shù),以揭示數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)特征。該法具有信息損失量小、相關(guān)性優(yōu)等特點[13-14]。在所得指紋圖譜中,6號峰為所有樣品共有,分離度較好、峰位相對居中而且峰面積較大,所以確定6號峰為參比峰。以各共有峰對6號峰的峰面積之比為相對峰面積,得到30批樣品的15個色譜峰的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)(見表4),采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行主成分分析。

主成分個數(shù)的提取原則是取主成分對應(yīng)的特征值大于1的2個主成分,其累計方差貢獻(xiàn)率為80.3%(見表5),表明該2個主成分能夠代表15個指標(biāo)在30批樣品中80.3%的信息。旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣見表6,由此可知每個載荷量表示主成分與對應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)[15]。以2個主成分的得分向量建立坐標(biāo)系得到主成分的得分圖(見圖4),由圖4可見30批樣品大致被分為兩大類,即黃刺玫果和山刺玫果。結(jié)果顯示黃刺玫果多聚集在PC1坐標(biāo)的負(fù)值區(qū)域,而山刺玫果多聚集在PC1坐標(biāo)的正值區(qū)域和PC2坐標(biāo)的中心區(qū)域,分類結(jié)果與相似度結(jié)果較一致,表明通過15個特征峰的相對峰面積可識別黃刺玫果和山刺玫果。

直觀分析這兩類樣品色譜峰的相對峰面積發(fā)現(xiàn),山刺玫果的7、12、13、14和15號共有峰的相對峰面積明顯大于黃刺玫,而黃刺玫果中的主要峰2、4、6、8和9號峰的峰面積明顯大于山刺玫,初步猜測這可能是造成這兩種樣品分類的主要原因。

表5 主成分方差分析Table 5 Analysis of variance for PCA

表6 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣Table 6 Rotated component matrixa

圖4 主成分得分圖Fig.4 PCA scores plot

2.7 聚類分析

聚類分析法(HCA)是以“物以類聚”為基本原則來研究事物分類的一種多元統(tǒng)計分析的方法[16]。在判別中藥質(zhì)量的過程中,經(jīng)常和PCA聯(lián)合應(yīng)用,即先通過PCA排除化學(xué)數(shù)據(jù)中微量和無效的干擾信息,再通過HCA進(jìn)行分類和質(zhì)量評估[17]。本研究采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件,以系統(tǒng)聚類法中的組間連接法、歐氏距離平方作為樣品測度,對30批刺玫果進(jìn)行聚類分析,并繪制樹狀圖(見圖5)。結(jié)果顯示,當(dāng)閾值T=25時,30批樣品被劃分為2類,其中S23～S30自成一類,即山刺玫組,其他22批黃刺玫被分為一類;隨著閾值的減小,22批黃刺玫繼續(xù)被劃分為2類,其中S2～S12和S15一類,其余10批樣品一類。分類結(jié)果與PCA的結(jié)果基本一致。

直觀分析被分為兩類的黃刺玫果的相對峰面積發(fā)現(xiàn),S2～S12和S15的色譜圖中2、4、8和9號共有峰的相對峰面積明顯小于其他樣品,而S2～S12均為曬干樣品,猜測可能是這4種化學(xué)組分性質(zhì)不穩(wěn)定,在曬干過程中受熱而發(fā)生了降解致峰面積變小,因此黃刺玫果因不同干燥方法被分為兩類,即陰干組和曬干組。而陰干組與S1冷凍鮮果的組分比較接近而被分為了一類,可見在陰干的過程中樣品中的化學(xué)成分相對比較穩(wěn)定。S15雖然也是陰干,但可能是因為儲存時間較長(2013年采集),樣品中不穩(wěn)定成分發(fā)生了降解而被分到了曬干組。由此可見,相同種類、不同產(chǎn)地樣品之間化學(xué)成分差異并不明顯,而不同干燥方法和儲存時間對樣品的影響較大。

圖5 系統(tǒng)聚類樹狀圖Fig.5 Dendrogram for the systematic clustering

3 結(jié)論

本研究以高效液相色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù),綜合運(yùn)用相似度評價、主成分分析和聚類分析對30批不同品種、產(chǎn)地和干燥方法的刺玫果樣品進(jìn)行了研究。從化學(xué)成分上揭示了不同品種和不同干燥方法的刺玫果之間的差異,并客觀地反映了刺玫果內(nèi)在質(zhì)量。結(jié)果30批刺玫果可根據(jù)品種不同快速被分為兩大類,然后黃刺玫又進(jìn)一步被分為陰干和曬干兩類。結(jié)果表明3種分析方法的結(jié)果基本一致,驗證了化學(xué)模式識別用于品種鑒定和歸類的可行性。該方法不僅可以用于刺玫果的品種鑒別和質(zhì)量評價,還可為下一步制定刺玫果的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

通過研究發(fā)現(xiàn),相同品種、不同產(chǎn)地的刺玫果化學(xué)成分較為一致,且人工栽培與野生黃刺玫果的品質(zhì)無顯著差異,這說明刺玫果具有較好的產(chǎn)地適應(yīng)性。而聚類分析結(jié)果可看出刺玫果可進(jìn)一步細(xì)分,表明不同干燥方法及儲存時間的刺玫果內(nèi)在化學(xué)成分及含量差異較大。天然產(chǎn)物化學(xué)成分普遍比較復(fù)雜,其對照品大多較難獲得[18],本研究采用化學(xué)模式識別的方法,無需對照品指認(rèn)色譜峰,為刺玫果的品種鑒定及質(zhì)量評價提供了參考。而刺玫果的藥理作用和化學(xué)成分的差異及相關(guān)性有待今后進(jìn)一步深入研究。

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