黃原膠/溶菌酶體系相轉(zhuǎn)變及其DSC分析

, ,, ,, ,,宇凡

(1.信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)院,河南信陽(yáng) 464000; 2.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院,河南信陽(yáng) 464000)

多糖和蛋白質(zhì)是食品體系中主要的兩類大分子,兩者復(fù)合體系相行為在很大程度上決定了食品的微觀和宏觀結(jié)構(gòu)[1-3],同時(shí)也影響著食品分子加工的功能特性、質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性等眾多食品特性[4-6],因此多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體系相行為的調(diào)節(jié)和控制一直被認(rèn)為是食品領(lǐng)域的重要課題。然而大多數(shù)蛋白質(zhì)和多糖對(duì)于外界環(huán)境的改變均很敏感,相轉(zhuǎn)變較易發(fā)生,且很難控制,主要是因?yàn)槎嗵呛偷鞍踪|(zhì)高分子易受電荷效應(yīng)、離子強(qiáng)度、pH等因素的影響,并在很大程度上決定了多糖/蛋白質(zhì)相轉(zhuǎn)變的發(fā)生[7-9]。

黃原膠(XG)和溶菌酶(Ly)是食品體系中兩種常見的配料分子,在以前的研究中利用葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)自動(dòng)酸化降低黃原膠/溶菌酶體系的pH,原位改變分子所帶電荷,從流變學(xué)及微觀角度建立了XG/Ly共溶體系、可溶性復(fù)合物、三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連續(xù)相轉(zhuǎn)變的發(fā)生參數(shù)[10];基于此環(huán)境誘導(dǎo)XG/Ly共溶體系條件下制備響應(yīng)性XG/Ly納米凝膠體系及其自聚集超結(jié)構(gòu)體系[11]。本文基于前期研究基礎(chǔ),通過透光率變化建立XG/Ly復(fù)合體系相轉(zhuǎn)變參數(shù),同時(shí)通過熱力學(xué)分析納米凝膠進(jìn)程中XG和Ly兩種大分子熱力學(xué)變化,探索兩種大分子在XG/Ly納米凝膠制備過程中的分子變化,分析其形成機(jī)理,為環(huán)境誘導(dǎo)條件下改善食品結(jié)構(gòu)以及新食品的設(shè)計(jì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃原膠(XG) 上海源葉生物有限公司;溶菌酶(Ly,Mw 14.3 kDa) 從雞蛋蛋清中提取,并二次結(jié)晶,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑 均為分析級(jí)；實(shí)驗(yàn)用水 均經(jīng)過Milli-Q(MA USA)純水凈化系統(tǒng)處理。

UV-1700型紫外分光光度儀 日本島津公司;204-F1型差示掃描量熱儀 德國(guó)Netzsch公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱取XG和Ly樣品,分別緩慢加入一定量超純水中,配制濃度均為1 mg/mL的溶液。XG溶液在室溫下攪拌6 h,Ly溶液攪拌2 h。XG和Ly溶液分別加入0.03%(w/w)疊氮化鈉后放入4 ℃冰箱貯藏備用。分別用1 mol/L鹽酸和氫氧化鈉將XG和Ly溶液pH調(diào)至pH12.5,按照不同質(zhì)量比(XG/Ly 3∶1、1∶1和1∶3)混合均勻，該體系分別標(biāo)記為XL31、XL11和XL13。

1.2.2 動(dòng)態(tài)pH和透光率測(cè)定 將上述不同XG/Ly質(zhì)量(3∶1、1∶1和1∶3)體系,在室溫條件下分別加入0.008%(w/v)葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)后利用數(shù)顯pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的變化,獲得pH隨時(shí)間變化曲線;重復(fù)上述操作,利用紫外可見分光光度計(jì)于600 nm測(cè)定不同XG/Ly體系在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)處的透光率,每組樣品測(cè)定3次[12-13]。

綜合同一時(shí)間點(diǎn)的pH和透光率,獲得不同XG/Ly復(fù)合體系自動(dòng)酸化過程中,透光率隨pH的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化。相互作用點(diǎn)(Interconnection point,pHφ)以透光率曲線兩端分別作切線,兩切線交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)pH即為該條件下XG/Ly相互作用的pH點(diǎn)[14-15]。

1.2.3 XG、Ly在其納米凝膠制備過程中DSC分析 利用差示掃描量熱儀分析XG/Ly共溶狀態(tài)兩種高分子的變化。分別模擬XG及Ly在不同pH(12.5、12.2、12、11.8)及熱處理(80 ℃,15 min)條件下,樣品進(jìn)行冷凍干燥處理。不同條件處理的XG樣品分別標(biāo)記為XG0、XG12.5、XG12.2、XG12、XG11.8及HXG12.5、HXG12.2、HXG12、HXG11.8,未處理、未加熱處理、加熱處理Ly樣品將分別標(biāo)記為L(zhǎng)y0、Ly12.5、Ly12.2、Ly12、Ly11.8及HLy12.5、HLy12.2、HLy12、HLy11.8。XG(3 mg)粉末樣品放入鋁坩堝中,以空坩堝作參比,掃描速率5 ℃/min,溫度范圍為0～350 ℃;Ly(5 mg)粉末樣品放入鋁坩堝中,加入10 μL超純水,并加蓋密封,于室溫下平衡24 h[16],以空坩堝作參比,具體參數(shù):掃描速率5 ℃/min,溫度范圍為30～90 ℃,整個(gè)測(cè)試過程是在N2保護(hù)下進(jìn)行,吹掃氣20 mL/min,保護(hù)氣60 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)pH下XG/Ly透光率變化

為研究XG/Ly體系在連續(xù)pH條件下的相轉(zhuǎn)變,采用在堿性環(huán)境下(pH12.5)加入GDL,使得XL31復(fù)合體系由于GDL緩慢酸化過程可連續(xù)降低體系的pH,圖1所示當(dāng)GDL開始酸化時(shí),XG/Ly體系相轉(zhuǎn)變也緩慢進(jìn)行,XG/Ly體系的透光率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)以不同速率下降。當(dāng)pH較高時(shí),XG與Ly均帶負(fù)電荷,分子間強(qiáng)烈的靜電相斥作用使得XG與Ly分子在高pH條件下以共溶的形式存在。但當(dāng)pH下降時(shí),Ly質(zhì)子化后開始帶正電荷,XG與Ly在靜電驅(qū)動(dòng)下形成復(fù)合物,使得復(fù)體體系的透光降低;當(dāng)pH近一步下降時(shí),逐步發(fā)生的聚集行為可導(dǎo)致XG/Ly體系形成微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這種相轉(zhuǎn)變過程在乳清蛋白/果膠復(fù)合體系也被報(bào)道過,其相轉(zhuǎn)變過程與XG/Ly體系相似[17]。

圖1 XL31體系在酸化過程的透明度變化Fig.1 Transmittance of XL31 system during acidification process

圖2 XL11(a)和XL13(b)體系在酸化過程的透明度變化Fig.2 Transmittance of XL11(a)and XL13(b) systems during acidification process

如圖2所示,盡管XG和Ly的質(zhì)量比有所不同,不同XG/Ly體系有著相似的規(guī)律,即透光率隨著pH的下降而下降,均形成復(fù)合物。但這種相轉(zhuǎn)變進(jìn)程不但和XG/Ly體系自身組成有關(guān),不同質(zhì)量比的XG/Ly體系在pH下降的過程中有著不同的規(guī)律。最初相同pH條件下,不同XG/Ly體系的透光率不盡相同,這主要是由于XG和Ly本身就具有不同的透光率。在低Ly體系中(XL31),透光率隨著pH的下降而下降,并在pH10.46左右處形成一個(gè)平臺(tái)區(qū),使得相轉(zhuǎn)變有明顯的階段性。高Ly體系(XL11和XL13)的透光率在酸化過程中快速下降,其下降速率高于XL31體系,這說明Ly可加快XG/Ly體系相轉(zhuǎn)變進(jìn)程,這也與通過流變學(xué)分析XG/Ly體系相轉(zhuǎn)變的結(jié)果相一致[10]。如圖1和圖2所示,XL31、XL11和XL13的相互作用點(diǎn)(Interconnection point,pHφ)分別為10.46、10.85和10.64,pHφ的數(shù)值也進(jìn)一步反應(yīng)XG/Ly體系中增加Ly含量有促進(jìn)該體系發(fā)生相轉(zhuǎn)變,而多糖起著相反的作用。這主要是因?yàn)楦嗟牡鞍卓梢酝ㄟ^物理相互作用與多糖結(jié)合,體系電荷被中和,可以在更短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到能量較低的穩(wěn)定狀態(tài)[18]。Le等研究者也發(fā)現(xiàn)低密度的多糖可以使多糖/蛋白體系的粘度更低,這樣可使得多糖蛋白分子鏈的運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散更為便捷,從而使相轉(zhuǎn)變較易發(fā)生[19]。

2.2 Ly制備納米凝膠過程中的DSC分析

圖3 不同pH(a)及熱偶聯(lián)作用(b)條件下Ly的熱力學(xué)圖譜Fig.3 Thermogram of Ly disposed by different pH or coupled with heat treatment

通過差示掃描量熱儀對(duì)Ly制備納米凝膠進(jìn)程進(jìn)行熱力學(xué)分析,如圖3a顯示了不同pH條件對(duì)Ly熱穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明在自然條件下Ly的熱變性溫度(Tm)為80 ℃,但當(dāng)pH為12、12.2、12.5時(shí),其熱變性溫度分別為99.4、98.7和109.7 ℃(圖4)。Tm的提高說明增加pH會(huì)提高Ly的熱穩(wěn)定性,同時(shí)這種熱力學(xué)穩(wěn)定增強(qiáng)效應(yīng)隨著pH的升高而提高。XG/Ly共溶態(tài)制備納米凝膠中,熱處理是所采用的方法之一,堿熱偶合處理Ly溶液的熱力學(xué)分析如圖3b所示。圖3b顯示在不同pH條件下,Ly的熱變性溫度變化規(guī)律同圖3a一致,即使在熱處理?xiàng)l件下,提高pH均可提高Ly的熱變性溫度,同圖3a相比,其增強(qiáng)效應(yīng)有近一步提高的趨勢(shì),當(dāng)pH為12.5時(shí),其熱變性溫度為113.5 ℃(圖4)。同時(shí)在強(qiáng)堿性(pH12.5)熱孵育條件下,在58 ℃處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)烈的放熱峰,這說明在該條件下,Ly的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化,如脫酰氨基作用的發(fā)生,這一點(diǎn)也與以前研究中紅外光譜結(jié)果一致[20]。

圖4 不同條件下Ly的熱變性溫度Fig.4 Thermal denaturation temperature of Ly disposed in different conditions

2.3 XG制備納米凝膠過程中的DSC分析

圖5 不同pH(a)及熱偶聯(lián)作用(b)條件下XG的熱力學(xué)圖譜Fig.5 Thermogram of XG disposed by different pH or coupled with heat treatment

如圖5所示,同未處理的XG0比較,XG制備納米凝膠過程中的熱力學(xué)特性深受pH和偶合熱處理的影響。雖然不同pH條件下的堿處理和偶合熱處理XG熱力學(xué)曲線均呈現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)烈的吸熱峰和放熱峰,但與未處理的XG0比較均出現(xiàn)了較大的峰位移現(xiàn)象,說明在制備納米凝膠過程中XG的分子構(gòu)象出現(xiàn)了較大改變,導(dǎo)致其熱力學(xué)特性隨之改變。如圖5,XG0在33 ℃及92.4 ℃顯示出兩個(gè)吸熱峰,這與其它結(jié)果相一致[21-23],然而在堿處理XG體系中,XG11.8、XG12、XG12.2及XG12.5溫度較低的吸附峰均未出現(xiàn),只顯示一個(gè)強(qiáng)的吸熱峰,與XG0相比該峰均向高溫方向出現(xiàn)了較大的移動(dòng);同時(shí)XG的吸熱峰均向低溫方向移動(dòng),說明堿熱后的XG較天然XG熱穩(wěn)定性變差,而XG12.5未出明顯的放熱峰,此時(shí)XG可能已發(fā)生部分堿降解行為。堿處理后XG與XG0相較表現(xiàn)出較大差異,原因主要是其分子構(gòu)象的變化,在堿處理下XG發(fā)生了脫乙酰行為,分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,pH越高,脫乙酰行為發(fā)生的越快,使XG從柔性分子變?yōu)橛残苑肿?從而導(dǎo)致其熱特性的較大改變[24-25]。

與堿處理XG相比,堿熱偶合處理增加了XG熱力學(xué)的變化。雖然堿處理是在強(qiáng)堿條件下進(jìn)行的,XG膠乙酰行為已經(jīng)完成,不需要加熱進(jìn)行輔助。但圖5b與XG0相比較,堿熱偶合處理仍對(duì)XG分子產(chǎn)生了一定影響,如HXG0放熱峰明顯比XG0寬,說明其熱穩(wěn)定性在一定程度上有所提高,與此同時(shí)HXG11.8、HXG12及HXG12.2均產(chǎn)生兩個(gè)放熱峰,說明體系中存在著兩種構(gòu)象的XG體系。這主要是因?yàn)閴A熱偶合處理一方面與單純堿處相同,使XG發(fā)生了脫乙酰的化學(xué)變化,也使天然的五股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了解旋行為,使原本穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,形成單鏈的游離態(tài),單鏈XG可在氫鏈作用形成有別于天然多股螺旋的不規(guī)則多股螺旋結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致熱力學(xué)上的差異性。圖5的結(jié)果也與以前的FTIR結(jié)果相一致,在堿熱處理過程中,不僅XG結(jié)構(gòu)中乙?；奶卣鞣?1725 cm-1)消失,也表現(xiàn)出現(xiàn)出更強(qiáng)的疏水性[11]。

3 結(jié)論

XG/Ly復(fù)合體系在GDL連續(xù)酸化過程中,其相轉(zhuǎn)變呈現(xiàn)pH階段性,并受到XG和Ly比例的影響。XL31、XL11和XL13的pHφ分別為10.46、10.85和10.64,呈現(xiàn)出高Ly含量的XG/Ly體系相轉(zhuǎn)變進(jìn)程較快。XG/Ly共溶態(tài)制備納米凝膠過程中XG及Ly原有結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變,堿或堿熱偶合處理可提高Ly的熱變穩(wěn)定性,但在此過程中XG發(fā)生脫乙酰行為,并在加熱處理過程中原有的多股螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋或發(fā)生重組行為。

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