氣相色譜法測(cè)定食品中12種有機(jī)酸

王韋崗，唐雙雙，陸 源

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鎮(zhèn)江212132）

食品中的有機(jī)酸是一類重要的風(fēng)味物質(zhì)，是構(gòu)成食品酸味的主要成分，其種類和含量對(duì)食品的風(fēng)味和酸度都有重要影響［1－2］。食品中有機(jī)酸的種類很多，主要來(lái)源于原材料和生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中，同時(shí)由于保存或者風(fēng)味的需要，會(huì)添加丙酸、山梨酸、苯甲酸、檸檬酸等功能性添加劑，這些功能性添加劑也是食品中有機(jī)酸的重要來(lái)源之一［3］。因此，檢測(cè)食品中有機(jī)酸的種類和含量，可以對(duì)食品的風(fēng)味和品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，有利于提升產(chǎn)品的質(zhì)量。

氣相色譜法是測(cè)定有機(jī)酸的常用方法［4－6］，該方法在進(jìn)樣分析前需對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行硅烷化或者甲酯化衍生處理［7－8］，其中衍生條件直接影響有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前采用氣相色譜法測(cè)定食品中有機(jī)酸的報(bào)道很多［9－12］，但是測(cè)定的有機(jī)酸種類較少，而且測(cè)定時(shí)未考慮衍生條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響［13－15］。本工作采用硫酸－甲醇法對(duì)12種有機(jī)酸進(jìn)行甲酯化衍生，衍生產(chǎn)物經(jīng)三氯甲烷萃取后進(jìn)行氣相色譜分析。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 7890A型氣相色譜儀，配7683B型自動(dòng)進(jìn)樣器，氫火焰離子化檢測(cè)器；WH－2微型渦旋混合儀；SB－800DT 型超聲波清洗機(jī)；Sartorius 3－30K型離心機(jī)；DHG－9246A型電熱恒溫干燥箱；Millpore超純水系統(tǒng)。

12種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取乙酸、乳酸、草酸、富馬酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品各1．0g，丙酸、正丁酸、正戊酸、山梨酸、琥珀酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品各0．10g，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，放置于4℃冰箱中避光保存。臨用前，分別用水逐級(jí)稀釋至所需質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

三氯甲烷、甲醇和乙酸為色譜純，硫酸為優(yōu)級(jí)純，草酸、亞鐵氰化鉀和硫酸鋅為分析純，丙酸、正丁酸、乳酸、正戊酸、山梨酸、富馬酸、琥珀酸、苯甲酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于99．4%；試驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18MΩ·cm）。

1．2 儀器工作條件

Agilent HP－5毛細(xì)管色譜柱（30m×0．32mm，0．25μm）；載氣為氮?dú)猓兌炔恍∮?9．999%），流量為0．8mL·min－1；空氣流量為400mL·min－1，氫氣流量為30mL·min－1；進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度為300℃；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；進(jìn)樣量為1．0μL。程序升溫：初始溫度為30℃，保持2 min；以4 ℃·min－1速率升溫到70 ℃；再以20℃·min－1速率升溫到250℃。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品的提取

稱取樣品2．5g于25mL具塞刻度試管中，先加入水10．0mL超聲提取10min，再分別加入106g·L－1亞鐵氰化鉀溶液2．0mL和300g·L－1硫酸鋅溶液2．0mL，渦旋混勻后用水稀釋至刻度。將稀釋后的樣品溶液轉(zhuǎn)移至50mL具塞離心管中，于8 000r·min－1轉(zhuǎn)速下離心5min。

1．3．2 樣品的衍生

移取上清液2．0mL于10mL具塞刻度試管中，加入20%（體積分?jǐn)?shù)，下同）硫酸－甲醇溶液4．0mL，渦旋混勻后放置在80℃電熱恒溫干燥箱中反應(yīng)60min，冷卻至室溫。移取衍生反應(yīng)后的溶液2．0mL于10mL具塞離心管中，加入水1．0mL和三氯甲烷2．0mL，混勻后以8 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心5min，移取下層三氯甲烷層，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

衍生后的12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig．1 Chromatogram of mixed standard solution of 12organic acids

2．2 衍生試劑的選擇

取12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為0，5%，10%，15%，20%的硫酸－甲醇溶液，于80℃衍生反應(yīng)60min，三氯甲烷萃取后進(jìn)行測(cè)定，考察了硫酸－甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 硫酸－甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Fig．2 Effect of volume fraction of H2SO4－CH3OH solution on determination results

由圖2可知：硫酸－甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)有機(jī)酸的甲酯化反應(yīng)具有重要作用；反應(yīng)體系中不含硫酸時(shí)，僅乙酸、丙酸、正丁酸、乳酸和正戊酸等低沸點(diǎn)易揮發(fā)的有機(jī)酸具有較好的信號(hào)響應(yīng)；隨著硫酸的加入，12種有機(jī)酸與甲醇的甲酯化反應(yīng)得以順利進(jìn)行；在相同的時(shí)間內(nèi)，隨著反應(yīng)體系中硫酸含量的增加，得到的12種有機(jī)酸衍生產(chǎn)物的峰面積也隨著增加；當(dāng)硫酸－甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為15%，20%時(shí)，12種有機(jī)酸衍生產(chǎn)物的峰面積相近。為保證樣品中的有機(jī)酸能夠完全甲酯化，試驗(yàn)選擇衍生試劑為20%硫酸－甲醇溶液。

2．3 衍生試劑加入量的選擇

取12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，分別加入20%硫酸－甲醇溶液0，1．0，2．0，4．0，6．0mL，于80℃衍生反應(yīng)60min，三氯甲烷萃取后進(jìn)行測(cè)定，考察衍生試劑加入量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 衍生試劑加入量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Fig．3 Effect of amount of derivative reagent on determination results

由圖3可知：衍生試劑的用量對(duì)低沸點(diǎn)易揮發(fā)有機(jī)酸的甲酯化反應(yīng)影響較小，對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)酸的甲酯化反應(yīng)影響很大；不加衍生試劑時(shí)，12種有機(jī)酸中乙酸、丙酸、正丁酸、乳酸和正戊酸等低沸點(diǎn)易揮發(fā)的有機(jī)酸出峰良好，高沸點(diǎn)有機(jī)酸沒(méi)有或者僅有微弱的信號(hào)響應(yīng)；隨著衍生試劑的加入，高沸點(diǎn)有機(jī)酸在硫酸的催化作用下與甲醇發(fā)生甲酯化反應(yīng)，沸點(diǎn)和極性均有所下降，從而提高了有機(jī)酸在氣相色譜中的響應(yīng)值；當(dāng)衍生試劑加入量為4．0，6．0mL時(shí)，12種有機(jī)酸衍生產(chǎn)物的峰面積達(dá)到最大值，繼續(xù)增加衍生試劑的加入量，12種有機(jī)酸衍生產(chǎn)物的峰面積無(wú)明顯變化。試驗(yàn)選擇衍生試劑的加入量為4．0mL。

2．4 衍生溫度的選擇

取12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，加入20%硫酸－甲醇溶液 4．0mL，分別在 40，60，80，100，120℃衍生反應(yīng)60min，三氯甲烷萃取后測(cè)定，考察了衍生溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 衍生溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Fig．4 Effect of derivative temperature on determination results

由圖4可知：衍生溫度太低不利于高沸點(diǎn)有機(jī)酸進(jìn)行甲酯化反應(yīng)；隨著衍生溫度的升高，高沸點(diǎn)有機(jī)酸衍生產(chǎn)物的峰面積逐漸增加；當(dāng)衍生溫度為60，80℃時(shí)，12種有機(jī)酸衍生產(chǎn)物的峰面積相近；隨著衍生溫度的進(jìn)一步升高，低沸點(diǎn)有機(jī)酸的衍生產(chǎn)物發(fā)生分解，測(cè)定得到的峰面積逐漸減少；當(dāng)衍生溫度升高到120℃時(shí)，乙酸、丙酸、正丁酸和正戊酸等低沸點(diǎn)有機(jī)酸衍生產(chǎn)物的色譜峰消失。試驗(yàn)選擇衍生溫度為80℃。

2．5 衍生時(shí)間的選擇

試驗(yàn)考察了衍生時(shí)間依次為0，10，20，40，60min時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明：衍生時(shí)間對(duì)低沸點(diǎn)易揮發(fā)的有機(jī)酸影響較小，在很短時(shí)間內(nèi)即可完成甲酯化反應(yīng)，高沸點(diǎn)的有機(jī)酸甲酯化反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積的比較，試驗(yàn)選擇衍生時(shí)間為60min。

2．6 萃取試劑的選擇

分別采用2．0mL正己烷、二氯甲烷和三氯甲烷萃取12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中12種有機(jī)酸的衍生產(chǎn)物，并按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，考察萃取試劑對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明：3種萃取試劑中正己烷的萃取效率較低，二氯甲烷和三氯甲烷萃取時(shí)具有較高的回收率，但是二氯甲烷與乙酸衍生產(chǎn)物的保留時(shí)間一致，并且無(wú)法將兩者進(jìn)行分離，采用二氯甲烷萃取衍生產(chǎn)物會(huì)干擾乙酸的測(cè)定。試驗(yàn)選用萃取試劑為三氯甲烷。

2．7 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

配制乙酸、乳酸、草酸、富馬酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸的質(zhì)量濃度均依次為1．0，2．0，4．0，6．0，8．0，10g·L－1，丙酸、正丁酸、正戊酸、山梨酸、琥珀酸和苯甲酸的質(zhì)量濃度均依次為0．10，0．20，0．40，0．60，0．80，1．0g·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取上述不同質(zhì)量濃度的12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2．0mL，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。以12種有機(jī)酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其衍生產(chǎn)物的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：12種有機(jī)酸的質(zhì)量濃度均在一定范圍內(nèi)呈線性，線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S／N），結(jié)果見(jiàn)表1。

2．8 精密度和回收試驗(yàn)

稱取2．5g樣品4份，其中1份樣品作為本底，另外3份樣品中加入高、中、低不同濃度水平的12種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行分析，精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2中“－”表示未檢出。

表1 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab．1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：12種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為76．0%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1．5%～6．9%。

空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖見(jiàn)圖5。

本工作建立了氣相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中12種有機(jī)酸的分析方法。本方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于食品中有機(jī)酸的測(cè)定。

圖5 空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖Fig．5 Chromatograms of blank sample and spiked sample

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