高效液相色譜法測定紅豆杉中紫杉醇及多烯紫杉醇的含量

周 斌，周 美，王道平＊，楊小生，王俊杰

（1．貴州健康職業(yè)學院，銅仁554300； 2．銅仁市食品藥品檢驗所，銅仁554300；3．貴州省中國科學院 天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴陽550002； 4．畢節(jié)醫(yī)學高等?？茖W校，畢節(jié)551700）

紅豆杉（Taxus）是國家一級保護野生珍稀抗癌植物，其主要含有芳香烴類、二環(huán)紫杉烷類、木脂素類及黃酮類等化學成分［1－2］，其中紫杉醇由于具有較好的抗癌活性而成為研究熱點。紅豆杉的樹皮、枝葉、根部，甚至種子均可提取紫杉醇［3］，多烯紫杉醇是在對紫杉醇結構改造過程中合成出來的紫杉醇衍生物［4］，主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、前列腺癌等多種實體腫瘤的治療，療效顯著，是繼紫杉醇后又一種新型抗微管藥物。在體外抗癌活性試驗中，多烯紫杉醇活性可達紫杉醇的10倍，體內(nèi)的親和性為紫杉醇的2倍。除此之外，多烯紫杉醇還具有生物利用度好、抗癌更廣譜及更好的水溶性、細胞內(nèi)濃度更高、毒副作用小的特點，與某些抗腫瘤藥物聯(lián)合使用時，還具有協(xié)同抗腫瘤作用［5］。許多體外和臨床研究均證實多烯紫杉醇對多種腫瘤細胞有放射增敏作用且不加重正常組織的放射損傷［6－7］。本工作以紫杉醇和多烯紫杉醇為指標，采用高效液相色譜法對紅豆杉雄性葉、枝皮，雌性葉、枝皮、綠色果肉、紅色果肉等不同部位進行了系統(tǒng)深入研究，研究結果可為紅豆杉的深度開發(fā)利用提供一定科學基礎。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀，配四元泵、在線脫氣機、自動控溫自動進樣、柱溫箱、DAD檢測器、色譜工作站；AG 285型十萬分之一天平；KQ－3000型數(shù)控超聲波清潔器；N－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SB－2000型水浴鍋。

混合對照品儲備溶液：取紫杉醇和多烯紫杉醇標準物質(zhì)，精密稱定，用乙腈溶解并定容，配制成紫杉醇和多烯紫杉醇質(zhì)量濃度分別為388．0，940．0mg·L－1的混合對照品儲備溶液。

紅豆杉采自貴州省湄潭縣，紫杉醇、多烯紫杉醇標準物質(zhì)（純度均大于98%），甲醇、二氯甲烷、正己烷均為分析純，乙腈為色譜純，水為純凈水。

1．2 儀器工作條件

Gemini－NX C18色譜柱 （250mm×4．6mm，5μm）；柱 溫 30 ℃；檢 測 波 長 227nm；流 量1．0mL·min－1；進樣量10．0μL，流動相A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～10min時，B由40%升至50%；10～13min時，B由50%升至53%；13～25min時，B由53%升至73%；25～27min時，B由73%降至40%，保持3min。

1．3 試驗方法

將紅豆杉按葉、枝、皮等不同部位分類放入烘箱，于50℃干燥后粉碎，過孔徑0．85mm篩，稱取2．000 0g置于錐形瓶中，加入甲醇－二氯甲烷（1＋1）混合液35mL浸泡18h后，超聲30min，過濾，濾渣用甲醇沖洗，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30℃水溫下回收濾液的溶劑，殘渣用20mL水轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用30mL正己烷萃取，棄去上層液，萃取3次后，水層用30mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收二氯甲烷，殘渣用甲醇轉(zhuǎn)移 至 5mL 容 量 瓶 中 并 定 容，混 勻［8－9］，用0．45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2．1 色譜行為

按儀器工作條件對混合對照品溶液進行測定，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液的高效液相色譜圖Fig．1 HPLC chromatogram of mixed reference solution

2．2 提取條件的選擇

試驗中所用樣品均為紅豆杉老樹大皮，所用的色譜條件是根據(jù)《中國藥典》2010年版二部中紫杉醇的有關物質(zhì)的檢測色譜條件［10］優(yōu)化而得，通過單因素考察和正交試驗后最終確定了提取方法。

2．2．1 浸泡時間

在其他試驗條件相同的情況下，試驗考察了浸泡時間分別為1，6，12，18，24，30h時的浸泡效果。結果表明：浸泡時間為24，30h時均達到最大浸泡效果。

2．2．2 甲醇－二氯甲烷體積比

在其他試驗條件相同的情況下，試驗考察了浸泡液甲醇與二氯甲烷體積比分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3時的浸泡效果。結果表明：甲醇與二氯甲烷的體積比為1∶1，即甲醇－二氯甲烷（1＋1）混合液的浸泡效果較好。

2．2．3 超聲時間

在其他試驗條件相同的情況下，試驗考察了超聲時間分別為10，15，30，45，60min時的提取效果。結果表明：超聲時間為30min時提取效果較好。

2．2．4 二氯甲烷萃取體積

在其他試驗條件相同的情況下，試驗考察了二氯甲烷萃取體積分別為10，20，30，40，50mL時的萃取效果，結果表明：二氯甲烷萃取體積為30mL時萃取效果較好。

影響紅豆杉中紫杉醇和多烯紫杉醇提取的主要因素有浸泡時間、甲醇－二氯甲烷體積比、超聲時間、二氯甲烷萃取體積，各取3個水平，進行L9（34）正交試驗，以綜合K值為評價指標，篩選出最佳提取條件，見表1。

表1 正交試驗表Tab．1 Orthogonal experiment

由表1可知：浸泡時間18h，甲醇與二氯甲烷的體積比1∶1，即甲醇－二氯甲烷（1＋1）混合液，超聲時間30min，二氯甲烷萃取體積30mL為最佳提取條件。

2．3 標準曲線及檢出限

逐級稀釋混合對照品儲備溶液，制得5個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按儀器工作條件進行測定，以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。結果表明：紫杉醇和多烯紫杉醇的線性范圍分別為0．19～97．00mg·L－1，0．46～182．40mg·L－1；線性回歸方程分別為y＝10．77x＋3．335，y＝7．140x＋3．386；相關系數(shù)均為0．999 9。

對質(zhì)量濃度最低的溶液逐級進行稀釋，以3倍信噪比計算方法的檢出限（3S／N），10倍信噪比計算測定下限（10S／N）。結果表明：紫杉醇和多烯紫杉醇的檢出限分別為0．06，0．02mg·L－1，測定下限分別為0．13，0．10mg·L－1。

2．4 精密度、穩(wěn)定性和重復性試驗

取19．4mg·L－1紫杉醇和45．6mg·L－1多烯紫杉醇的混合對照品溶液，重復測定6次，結果表明：紫杉醇峰面積的相對標準偏差（RSD）為0．62%，多烯紫杉醇峰面積的RSD為0．71%，說明精密度較好。

取供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，24h進樣測定，結果表明：紫杉醇峰面積的RSD為0．83%，多烯紫杉醇峰面積的RSD為1．3%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

取紅豆杉老樹大皮樣品，共6份，分別按試驗方法制備供試品溶液，進樣測定。結果表明：紫杉醇的質(zhì)量分數(shù)為0．139 5g·kg－1，測定值的 RSD 為1．2%，多烯紫杉醇的質(zhì)量分數(shù)為0．001 8g·kg－1，測定值的RSD為1．4%，說明方法的重復性較好。

2．5 回收試驗

取各對照品儲備溶液適量，稀釋成不同濃度水平的混合對照品溶液，稱取已知含量的紅豆杉樣品6份，每份2．000 0g，分別加入一定量的上述混合對照品溶液，按試驗方法處理樣品后進行測定，結果見表2。

2．6 樣品分析

取紅豆杉粉末樣品，按試驗方法制備供試品溶液，在儀器工作條件下進樣，記錄各色譜峰面積，計算各樣品中紫杉醇和多烯紫杉醇的含量，結果見表3，其中“－”表示該化合物未檢出。

表2 回收試驗結果（n＝6）Tab．2 Results of test for recovery（n＝6）

表3 樣品分析結果Tab．3 Analytical results of samples

本工作通過對提取過程中的浸泡時間、甲醇－二氯甲烷的體積比、超聲時間、二氯甲烷萃取體積進行篩選，得出最佳提取條件，采用高效液相色譜法同時對紅豆杉中紫杉醇和多烯紫杉醇的含量進行測定。方法簡便、快速，重現(xiàn)性好，結果準確，可為進一步研究紅豆杉的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。

［1］ 袁遙，劉佳佳，陳淑娟，等．紅豆杉內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的分離與鑒定［J］．中南林業(yè)科技大學學報，2010，30（5）：101－105．

［2］ 文亞峰，謝偉東，韓文軍，等．南嶺山地南方紅豆杉的資源現(xiàn)狀及其分布特點［J］．中南林業(yè)科技大學學報，2012，32（7）：1－5．

［3］ 王玉震，仝川，柯春婷．紅豆杉植株紫杉醇含量研究進展［J］．亞熱帶植物科學，2008，37（4）：59－63．

［4］ 景臨林，金瑛，張生勇，等．抗癌藥物多烯紫杉醇的合成［J］．中國藥物化學雜志，2006，16（5）：292－294．

［5］ 史筱倩．多西他賽不良反應及分析［J］．中國醫(yī)藥導報，2009，6（6）：90－91．

［6］ 楊孝來．紫杉醇與多烯紫杉醇［J］．實用藥物與臨床，2010，13（4）：281－283．

［7］ 李鵬，李春香，李想．多烯紫杉醇的合成工藝研究［J］．中國藥物化學雜志，2009，19（5）：356－360．

［8］ 盧建偉．加拿大紅豆杉中紫杉醇提取分離工藝及含量測定研究［D］．長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2007．

［9］ 牙啟康．南方紅豆杉各部位中紫杉醇的含量測定和其果蒂氯仿萃取部分的成分研究［D］．桂林：廣西師范大學，2003．

［10］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典二部［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010．