硫磺負(fù)離子添加劑對SD大鼠的發(fā)育毒性研究

馮金曼， 崔明勛， 姜成哲*， 金 美， 李 鎬

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2. 延邊大學(xué)藥學(xué)院:吉林 延吉 133002)

現(xiàn)在的新型飼料添加劑已經(jīng)能夠滿足生產(chǎn)中的很多特殊需求，應(yīng)用范圍也被擴大到各類動物的養(yǎng)殖業(yè)中[1]。礦物質(zhì)飼料添加劑合理地配制及使用，能夠在很大程度上保證動物的健康并提高動物的生產(chǎn)力，但若采食的礦物質(zhì)數(shù)量超過了自身需要量或承受限度時，就會發(fā)生中毒或引起不良影響。礦物質(zhì)飼料添加劑產(chǎn)品質(zhì)量的安全性問題，主要是限制有毒害元素的最大允許量，并以標(biāo)準(zhǔn)形式做出明確規(guī)定[2]。礦物質(zhì)飼料添加劑是當(dāng)今社會使用最多的飼料添加劑之一，約占飼料添加劑總用量的66%～72%。

該試驗研究的硫磺負(fù)離子添加劑是將存在于大自然的多種礦物質(zhì)用現(xiàn)代高科技納米技術(shù)對礦物質(zhì)進(jìn)行粉碎、篩選、分離、烘干等程序加工，并按合理的科學(xué)配比混合而成。本產(chǎn)品可廣泛使用于雞鴨、豬狗、牛羊等家畜飼養(yǎng)及魚、蝦等水產(chǎn)類養(yǎng)殖，也可使用于蔬菜、瓜果類的種植和栽培。本產(chǎn)品具有解毒、祛毒功效，所以對提高動植物健康質(zhì)量起到很好的作用[3-5]。

致畸敏感期毒性在評判受試物的毒性時發(fā)揮重要的作用。該試驗的目的是觀察硫磺負(fù)離子礦物質(zhì)添加劑經(jīng)口服后對SD受孕雌鼠產(chǎn)生的敏感期致畸毒性。通過觀察母鼠及胎兒的多項指標(biāo)來判斷硫磺負(fù)離子添加劑對實驗動物的生殖及胎兒發(fā)育是否有毒性或致畸作用。為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品

硫磺負(fù)離子添加劑由吉林省延吉市永大飼料有限公司提供。甲醛、乙醇、氫氧化鉀、甘油、茜素紅、苦味酸、乙酸、羧甲基纖維素(CMC)都是國產(chǎn)分析純。乙醇固定液(95%乙醇)、飽和苦味酸溶液、鮑因氏(Bouins)固定液、茜素紅應(yīng)用液、1% CMC溶液。

硫磺負(fù)離子添加劑混懸液：

低劑量(T1組)：100 mg/100 mL。

中劑量(T2組)：333 mg/100 mL。

高劑量(T3組)：1 000 mg/100 mL。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

試驗動物：SD大鼠，雌性體重為220～280 g，雄性體重為350～400 g，雌性鼠均是未進(jìn)行過交配的大鼠，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于延邊大學(xué)藥學(xué)院動物實驗室的屏障環(huán)境設(shè)施內(nèi)。室溫20～26 ℃，濕度40%～70%。SD大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)盒內(nèi)喂養(yǎng)，每籠大約3～5只，自由飲水和進(jìn)食。飼料是由延邊大學(xué)飼料中心提供的全價飼料，實驗室內(nèi)自來水經(jīng)過初步過濾處理后供大鼠飲用。

1.2.2 實驗動物分組

將實驗的SD大鼠，按照雌雄2∶1的比例同籠混合交配，第2天凌晨給雌鼠作陰道涂片，在顯微鏡下觀察涂片看是否有精子或陰道栓出現(xiàn)，將能觀察到的雌鼠作為受孕0 d，然后將受孕雌鼠隨機分為4組，每組15只，所分4組分別為硫磺負(fù)離子高、中、低劑量組，及1% CMC溶液對照組(5 mL/kg)。所有孕鼠都于受孕第6～15天(致畸敏感期)灌胃給藥，按照體重的不同給藥量均為10 mL/kg。

1.2.3 一般體征檢查

每天及時觀察孕鼠毛色、五官、行為等一般體征狀況，記錄是否有異常情況出現(xiàn)。各組受孕雌鼠在受孕的3、6、9、12、15、18 d稱量添加的飼料量，次日同一時間稱量剩余的飼料量，減少的飼料量即為當(dāng)日大鼠的進(jìn)食量。

雌鼠于受孕后第20天將全部處死，觀察有無異?；虿∽兣K器。剖開子宮取出胎鼠(先做外觀檢查)、胎盤，記錄黃體數(shù)，觀察統(tǒng)計死胎數(shù)(早期死胎、晚期死胎)、著床數(shù)、吸收胎數(shù)，活胎數(shù)，稱量活胎重、胎盤重，用游標(biāo)卡尺測量胎鼠體長、尾長、肛長(肛門到尿道的距離)，統(tǒng)計胎鼠性別數(shù)，外觀是否異常等。測量完上述事項后將約1/2胎鼠固定于Bouins氏液，作內(nèi)臟檢查，其余的固定于95%乙醇溶液中作骨骼畸形檢查。

胎鼠的外觀檢查：先檢查胎鼠的頭部，觀察有無露腦，腦膜膨出等情況；觀察胎鼠頭部大小，是否有特別小或特別大的畸形情況；胎鼠五官中眼，耳，口，鼻的外觀有無異常情況；上下頜有無唇裂；然后進(jìn)行四肢、軀干及尾部的檢查；觀察胎鼠有無腹部裂開，臍疝，脊柱斷裂，脊髓膨出，脊柱側(cè)突等情況；觀察胎鼠的尾巴有無短尾，卷尾，無尾等情況。

1.2.4 胎鼠的內(nèi)臟檢查

大約2周后取出固定在Bouins液中的胎鼠，用流水沖去固定液，用單面刀片對胎鼠進(jìn)行切片檢查。檢查時先將胎鼠放在蠟板或者木板上，切去胎鼠的四肢和尾部，用左手固定住胎鼠，然后右手持刀片從頭部開始往下做橫切或者縱切[6]。根據(jù)不同部位的斷面情況觀察胎鼠器官發(fā)育的大小、性狀和相對位置是否正常。

沿胎鼠腹中線切開胸腔、腹腔，檢查胎鼠的肺、心、橫膈膜、肝、胃、脾、腸等器官的大小、位置及是否畸形。檢查完畢后均將其摘除，然后檢查胎鼠的腎、輸尿管、膀胱、子宮或睪丸的大小、位置及發(fā)育情況。最后將腎臟切開，檢查是否有腎盂積水和擴大[7]。

活胎率/%=活胎仔數(shù)/胎仔總數(shù)×100%

死胎率/%=死胎在數(shù)/胎仔總數(shù)×100%

畸胎率/%=有畸胎動物數(shù)/妊娠動物數(shù)×100%

吸收胎率/%=(早期吸收數(shù)+中期吸收數(shù)+晚期吸收數(shù))/胎仔總數(shù)×100%

早期吸收胎率/%=早期吸收數(shù)/胎仔總數(shù)×100%

晚期吸收胎率/%=晚期吸收數(shù)/胎仔總數(shù)×100%

外觀畸形率/%=外觀畸形數(shù)/檢查胎仔數(shù)×100%

骨骼畸形率/%=骨骼畸形數(shù)/檢查骨骼標(biāo)本數(shù)×100%

骨骼異常率/%=骨骼異常數(shù)/檢查骨骼標(biāo)本數(shù)×100%

1.2.5 胎鼠的骨骼檢查

2～3周后取出放在95%乙醇中固定的胎鼠，對胎鼠進(jìn)行去皮、摘除內(nèi)臟和脂肪(特別是背部脂肪)的操作。

染色完成后將胎鼠標(biāo)本放入小平皿中，加入少量丙三醇溶液，用透視顯微鏡對胎鼠進(jìn)行整體觀察，然后對胎鼠的骨骼發(fā)育情況進(jìn)行檢查。先檢查胎鼠頭部的頭頂骨、側(cè)頭骨及后頭骨有無缺損及骨化情況，然后檢查胸骨的骨化數(shù)目，有無缺失或融合情況。接著檢查胎鼠的肋骨，觀察是否有畸形情況出現(xiàn)，如融合肋、波狀肋、短肋、分叉肋、肋骨中斷、缺肋、多肋等。檢查胎鼠頸椎、脊柱和椎體骨化數(shù)目(一般情況是頸椎骨化數(shù)7個，胸椎骨化數(shù)12～13個，腰椎骨化數(shù)5～6個，骶椎和尾椎骨化數(shù)7～9個)、有無融合及縱裂等情況。最后檢查四肢骨發(fā)育情況及前后掌趾骨的骨化數(shù)目[8-9]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本試驗的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行求平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和t檢驗。本試驗所有比率的數(shù)據(jù)分析比較均用X2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組孕鼠一般體征的觀察

各組孕鼠的皮毛顏色及光澤、五官等外觀，生理體征及日常行為等均未見異常。孕鼠的排泄物、分泌物等也均正常，無流產(chǎn)或死亡。

2.2 硫磺負(fù)離子添加劑對孕鼠進(jìn)食量的影響

各組受孕雌鼠在受孕的第3、6、9、12、15和18 d稱量添加的飼料量，次日同一時間稱量剩余的飼料量，減少的飼料量即為當(dāng)日大鼠的進(jìn)食量。對同一天的各組進(jìn)食量求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并對試驗組與對照組作t檢驗(表1)。T1組在12 d和T3組在9、12 d的進(jìn)食量都較對照組顯著增加(P<0.05)，其他組其他時間試驗組與對照組比較均無顯著差異，但是試驗組的進(jìn)食量都較對照組多。

表1 妊娠期間雌鼠進(jìn)食量變化結(jié)果(mean ± SD)

注：*表示T組與C組比較，P<0.05，則有顯著差異。

2.3 硫磺負(fù)離子添加劑對孕鼠體重的影響

硫磺負(fù)離子添加劑對母體體重增長的情況經(jīng)常被認(rèn)為是母體毒性的評判標(biāo)準(zhǔn)之一。在胚胎發(fā)育的致畸敏感期毒性試驗中，從受孕第0天開始，在第3、6、9、12、15、18、20天稱量雌鼠的體重，第20天為解剖日。統(tǒng)計各組孕鼠的體重變化情況如表2，同一天的各組大鼠體重情況之間做t檢驗(P>0.05)，20 d母鼠體重的增加量各組之間也做了t檢驗(P>0.05)，均無顯著差異。

表2 妊娠期間雌鼠體重變化結(jié)果(mean ± SD)

2.4 硫磺負(fù)離子添加劑對胚胎的影響

受孕后第20天將全部孕鼠處死，剖開子宮取出胎鼠(先做外觀檢查)、胎盤，記錄黃體數(shù)，觀察統(tǒng)計死胎數(shù)(早期死胎、晚期死胎)、著床數(shù)、吸收胎數(shù)，活胎數(shù)，稱量活胎重、胎盤重，用游標(biāo)卡尺測量胎鼠體長、尾長、肛長(肛門到尿道的距離)，統(tǒng)計胎鼠性別數(shù)，外觀是否異常等。各組實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果如表3。結(jié)果表明，各實驗組的測定結(jié)果與對照組以及各實驗組之間無顯著差異，說明添加劑對胚胎無不良影響。

表3 硫磺負(fù)離子添加劑對胚胎的影響 (mean ± SD)

2.5 硫磺負(fù)離子添加劑對胎鼠發(fā)育情況的影響

本試驗對胎鼠的外觀進(jìn)行檢查，所有胎鼠均未出現(xiàn)明顯的肉眼可見的畸形現(xiàn)象。胎鼠的胎盤重量T1組與C組比較有極顯著的增加(P<0.01)；T3組與C組比較有顯著的增加(P<0.05)；T2組重量稍微有減少，但是與C組比較無顯著差異(P>0.05)。T1組胎鼠的重量較C組有極顯著的增加(P<0.01)；T2組胎鼠的重量較C組有顯著增加(P<0.05)；T3組胎鼠的重量與C組無顯著差異；T1組雌性胎鼠的肛長較C組顯著變長(P<0.05)；T1組雌性胎鼠的體長較C組極顯著變長(P<0.01)；T2組雄性胎鼠的尾長較C組顯著變短(P<0.05)，雌性胎鼠的尾長顯著變長(P<0.05)；其他各組數(shù)據(jù)與對照組均無顯著差異(表4)。

表4 硫磺負(fù)離子添加劑對胎兒體重等的影響 (mean ± SD)

注：*表示T組與C組比較，P<0.05，有顯著差異；**表示T組與C組比較，P<0.01，有極顯著差異。

2.6 硫磺負(fù)離子添加劑對胎鼠外觀特征的影響

對硫磺負(fù)離子添加劑的3個劑量組與對照組的胎鼠進(jìn)行外觀檢查，胎鼠的頭部、五官、軀干、四肢、尾部及肛門等均未見畸形，表明該產(chǎn)品對胎鼠的外觀發(fā)育無明顯影響。在高劑量組出現(xiàn)1例胎鼠個體非常小，但是外觀無異常。

2.7 硫磺負(fù)離子添加劑對胎鼠內(nèi)臟發(fā)育情況的影響

胎鼠整體經(jīng)Bouins液固定后取出進(jìn)行切片觀察，硫磺負(fù)離子添加劑各試驗組與對照組胎鼠內(nèi)臟及腦內(nèi)結(jié)構(gòu)情況統(tǒng)計如表5。經(jīng)Bouins液固定后的胎鼠情況如圖1，胎鼠皮膚呈黃色，表面皺縮，但是組織和內(nèi)臟等細(xì)微結(jié)構(gòu)基本未發(fā)生變化。

對胎鼠的內(nèi)臟及腦部情況進(jìn)行切片觀察，僅將出現(xiàn)異常的數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表5，4個試驗組中均無畸形胎兒出現(xiàn)。雖然有個別胎鼠出現(xiàn)頭部異常、胸腺異常、腎盂和膀胱擴張等現(xiàn)象，但是數(shù)量很少，3個劑量組與對照組比較均無顯著差異。

表5 硫磺負(fù)離子添加劑對胎兒內(nèi)臟的影響 (mean ± SD)

圖1 Bouins液中固定的胎鼠

2.8 硫磺負(fù)離子添加劑對胎鼠骨骼發(fā)育情況的影響

胎鼠的骨骼發(fā)育存在變異，包括胸骨和肋骨骨化不全；掌骨和頭骨、骶骨和尾骨骨化程度不一樣。肋骨有融合或斷裂，頭骨的頭頂骨、側(cè)頭骨和后頭骨骨化不全。胎鼠骨骼檢查主要表現(xiàn)為胸骨、骶骨和尾骨骨化數(shù)目不同。胸骨主要表現(xiàn)為第5、6胸骨的缺失；前掌骨主要是第1、5趾骨骨化不全，后掌骨主要是第1趾骨骨化不全；肋骨主要異常是斷肋；枕骨的0級骨化率在99%以上。胎鼠染色成功后的情況如圖2所示，只有骨骼呈紅色，其他組織均是透明。在透射光源下觀察胎鼠的情況如圖3所示，能清晰的觀察到胎鼠的骨化情況。

對胎鼠的骨骼發(fā)育情況統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表6所示，胎鼠的頭骨、胸骨、掌骨及肋骨的骨化數(shù)試驗組與對照組比較均無顯著差異。各組胎鼠中均出現(xiàn)骨化不全的胎鼠，但是數(shù)量較少，各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 胎鼠骨骼染色后情況

圖3 透射光源下的胎鼠標(biāo)本

項目組別C組T1組T2組T3組檢查數(shù)55546260頭骨骨化數(shù)5．87±0．825．85±0．836．00±0．005．87±0．60胸骨骨化數(shù)3．98±1．254．20±1．004．39±1．063．53±1．28前掌骨化數(shù)5．91±1．255．87±0．876．06±0．965．70±1．60后掌骨化數(shù)7．00±2．267．63±1．616．94±2．016．67±2．75肋骨骨化數(shù)12．9±0．1312．7±1．7712．9±0．1312．9±0．28骶骨和尾骨骨化數(shù)12．7±2．0111．57±2．0412．34±0．9610．28±2．05頭骨骨化不全1103肋骨骨化不全1115

2.9 各組數(shù)據(jù)與SD大鼠致畸敏感期指標(biāo)背景基數(shù)的比較

本試驗有關(guān)內(nèi)臟檢測數(shù)據(jù)的計算按照1.2.4中的方法公式獲得，與SD大鼠致畸敏感期指標(biāo)背景基數(shù)的比較，都沒有顯著的差異，具體如表7所示。

表7 各組數(shù)據(jù)與SD大鼠致畸敏感期指標(biāo)背景基數(shù)的比較(mean ± SD)

3 討論與結(jié)論

發(fā)育中的胚胎或胎兒對致畸物的感受是一個復(fù)雜的過程。礦物質(zhì)飼料添加劑的影響要從母鼠和胎兒2個方面分別去分析。

妊娠期間母鼠的進(jìn)食量可見硫磺負(fù)離子添加劑能提高大鼠的食欲，增加其進(jìn)食量。雖然母鼠妊娠期間體重增加沒有顯著差異，但是試驗組增加量還是高于對照組，分析原因可能是試驗組母鼠進(jìn)食量增加導(dǎo)致體重增加。在試驗過程中觀察母鼠的外觀及解剖后觀察母鼠的主要臟器，均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性現(xiàn)象。可見，硫磺負(fù)離子添加劑在本試驗劑量時對母鼠無毒性作用。

本試驗中胎仔發(fā)育的各項指標(biāo)等數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，硫磺負(fù)離子對胎兒的發(fā)育不僅沒有抑制作用，在一定程度上還存在促進(jìn)作用，不存在明顯的毒性作用。通過這些數(shù)據(jù)可知，各組胎鼠的生長發(fā)育情況基本正常，無明顯的抑制現(xiàn)象?？傊?，在該試驗過程中胎鼠未出現(xiàn)致畸現(xiàn)象。

在觀察硫磺負(fù)離子添加劑對胎兒內(nèi)臟的影響時，雖然各組均有少量胎兒異常，但是各組個體之間無統(tǒng)計學(xué)意義，即對胎兒內(nèi)臟發(fā)育沒有毒性作用。各試驗組與對照組比較均無顯著差異。頭骨骨化數(shù)均在6左右，發(fā)育正常。胸骨骨化數(shù)在4左右，一般是第5,6胸骨骨化不全，各組之間無顯著差異。左右前掌骨化數(shù)之和在6左右，主要是第1、5趾骨骨化不全；左右后掌骨骨化數(shù)在7左右，主要是第1趾骨骨化不全，各組與對照組比較均無顯著差異。肋骨骨化數(shù)基本在13左右，有個別第13肋骨骨化不全。骶骨和尾骨骨化數(shù)高劑量組與其他各組之間差異較大，但是無顯著差異，分析原因可能是高劑量組有1只母鼠所產(chǎn)的胎仔骨化情況都不好，其中有1只胎仔個體很小，全身無骨化情況，屬于發(fā)育遲緩，但是整體與對照組比較無顯著差異?？赡苁翘涸诎l(fā)育過程中營養(yǎng)不良導(dǎo)致的，僅1例胎鼠個體異常小的現(xiàn)象不能說明硫磺負(fù)離子添加劑對胎兒的發(fā)育存在毒性[10]。

孕鼠懷孕的第6天開始受精卵著床，在第6～15天的這段時期長期以來被稱為致畸敏感期[11]。一般致畸敏感期實驗是選擇在動物的致畸敏感期進(jìn)行染毒，該試驗不但能檢測受試物的致畸性，還可以觀察受試物致胚胎、胎仔死亡和生長遲緩等情況，是目前檢測外源受試物致畸毒性最經(jīng)典也是最可靠的方法。最近以來，利用實驗動物在民族醫(yī)藥及疾病模型等研究方面不斷有新的進(jìn)展[12-16]。本研究采用SD大鼠做常規(guī)致畸敏感期毒性試驗，檢測硫磺負(fù)離子添加劑對孕鼠和胚胎發(fā)育的毒性，結(jié)果顯示在100 mg/kg及以下劑量組，孕鼠均未見母體毒性，胚胎、胎仔各項生長發(fā)育指標(biāo)及外觀、內(nèi)臟檢查、骨骼檢查也均未見異常；各劑量組與對照組比較雖然有數(shù)例胎鼠出現(xiàn)胸骨缺失，肋骨發(fā)育不全等現(xiàn)象，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明胸骨缺失屬于正常現(xiàn)象，并非處理因素的結(jié)果。高劑量組較陰性對照組胎仔的發(fā)育情況稍微有差異，但是無統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因可能是本品為礦物質(zhì)不溶于水，只能配成混懸液對孕鼠進(jìn)行灌胃，可能對母鼠的刺激較強，對母鼠會產(chǎn)生一定的影響，但是不能判斷為毒性現(xiàn)象。

總之，硫磺負(fù)離子添加劑在本試驗劑量時對孕鼠及胎仔的發(fā)育及健康無明顯的毒性作用。

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