人參銹腐病生防用菌劑制作及效果檢測(cè)

邊 雪, 王 偉, 崔 凡, 屈俊廷， 李熙英,2*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2.延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室:吉林 延吉 133002)

人參銹腐病[Cylindrocarpondestructans(Zinss) Scholten]為人參根部最主要的病害之一，一般發(fā)病率20%～30%，個(gè)別嚴(yán)重地塊可達(dá)70%以上[1]。人參銹腐病因厚垣孢子在土壤中以休眠的方式可在無(wú)寄主的條件下長(zhǎng)期存活，使土壤帶菌，直接影響下一茬人參的種植，造成人參連作障礙[2-3]。目前，人參銹腐病的防治主要采用農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等。韓潤(rùn)亭等[4]利用氯化苦進(jìn)行人參銹腐病田間防病試驗(yàn)，對(duì)人參銹腐病防治效果達(dá)54.78%～70.07%,明顯優(yōu)于多菌靈的防治效果。馬鳳茹等[5]、王麗華等[6]用50%棉隆可濕性粉劑處理土壤防治銹腐病防效顯著，用棉隆處理土壤的參根重量比用多菌靈處理土壤的參根重量高出近1倍, 且不影響人參皂貳的含量。但植物病害化學(xué)防治常導(dǎo)致“3R”問題以及環(huán)境污染、藥害、人畜中毒、農(nóng)田生態(tài)平衡與生物多樣性的破壞等一系列的社會(huì)問題[7]。

人參銹腐病生物防治方面[8-14]，主要圍繞人參地土壤微生物多樣性調(diào)查，拮抗菌的分離、鑒定及田間防病試驗(yàn)，拮抗菌發(fā)酵條件研究，現(xiàn)有微生物菌劑應(yīng)用于人參銹腐病防治中等方面進(jìn)行，但未見人參銹腐病生防用的菌劑開發(fā)及效果方面的研究報(bào)道。

該試驗(yàn)以楊樹上分離到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌菌株Y-S-Y12以及參地土壤分離到的YBN13和YBN18[15]等拮抗菌菌株制作菌劑并檢測(cè)菌劑有效性，以期為人參銹腐病生防菌劑開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌

人參銹腐病菌(Cylindrocarpondestructans(Zins.))；供試拮抗菌有Y-S-Y12菌株、YBN13菌株和YBN18菌株。Y-S-Y12菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；YBN13和YBN18菌株為芽孢桿菌屬的細(xì)菌Bacillssp，登錄號(hào)分別為JX156418和JX156419。上述病原菌和拮抗菌均由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室保存。

1.2 拮抗菌劑制作

拮抗菌菌株Y-S-Y12、YBN13、YBN18進(jìn)行活化后，在無(wú)菌操作臺(tái)上用接種環(huán)將拮抗菌接入已滅好菌的裝200 mL KB培養(yǎng)液的三角瓶中(菌量為1接菌環(huán))，在28 ℃、120 r/min 恒溫雙層搖床中振蕩培養(yǎng)5 d后，經(jīng)4 000 r/min離心25 min，得到細(xì)菌菌體。將離心所得的細(xì)菌菌體與100 g的A、B、C 3種營(yíng)養(yǎng)載體相互混合，每種營(yíng)養(yǎng)載體混合200 mL菌液中的細(xì)菌菌體。攪拌均勻后，置于室內(nèi)陰暗干燥處，自然風(fēng)干，防止陽(yáng)光直射。

A、B、C 3種不同的營(yíng)養(yǎng)載體，配方如下。

A：滑石粉100 g，葡萄糖2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蛋白胨3 g，拮抗菌培養(yǎng)液200 mL中培養(yǎng)的細(xì)菌量。

B：高嶺土100 g，葡萄糖2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蛋白胨3 g，拮抗菌培養(yǎng)液200 mL中培養(yǎng)的細(xì)菌量。

C：活性炭100 g，葡萄糖2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蛋白胨3 g，拮抗菌培養(yǎng)液200 mL中培養(yǎng)的細(xì)菌量。

1.3 菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的檢測(cè)

不同菌劑中拮抗菌存活數(shù)的檢測(cè)，采用平板計(jì)數(shù)法。

具體方法如下：分別在制作菌劑后1、10、20、30、40、50、75和100 d時(shí)取菌劑樣品1.00 g，采用梯度稀釋法得到10-4、10-5和10-6濃度的菌劑稀釋液，用移液器分別吸取不同稀釋濃度的稀釋液0.02 mL，滴在預(yù)先備好的KB固體培養(yǎng)基平板上，分別用無(wú)菌涂布棒均勻涂于瓊脂平板表面。每一稀釋度重復(fù)5個(gè)培養(yǎng)皿。將做好的平板倒置放于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后調(diào)查長(zhǎng)出的菌落數(shù)目,計(jì)算活菌數(shù)目。

1.4 保存100 d后菌劑對(duì)人參銹腐病菌的抑菌作用

制作的不同菌劑保存100 d后，取菌劑樣品1.00 g，加入裝有39 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分振蕩10 min，備用。人參銹腐病菌在PDA平板上活化7 d。用打孔器打出直徑8 mm的人參銹腐病菌菌碟，放入PDA平板中間，人參銹腐病菌菌碟兩邊15 mm處放置已滅菌的濾紙片(d=5 mm)，濾紙片上滴上述菌劑懸浮液0.1 mL，每個(gè)處理重復(fù)5個(gè)培養(yǎng)皿，只接人參銹腐病菌菌碟為對(duì)照。20 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 d，測(cè)人參銹腐病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率計(jì)算公式如下：

1.5 拮抗菌菌劑田間防病試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)Y-S-Y12、YBN13、YBN18、Y-S-Y12+YBN13、Y-S-Y12 +YBN18、YBN13+YBN18等6種菌劑處理，其中,混劑為2種菌劑的1∶1混合物。

試驗(yàn)在吉林省安圖縣大荒溝林場(chǎng)人參地中進(jìn)行。試驗(yàn)用人參苗為2年生苗，選擇大小基本相同，無(wú)病菌感染的參苗。移栽時(shí)，于40倍液菌劑中浸泡人參苗20 min后撈出，進(jìn)行移栽。

試驗(yàn)地設(shè)14個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積30 m2,試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，第1區(qū)組為滑石粉制作的菌劑(A劑型)，第2區(qū)組為高嶺土制作的菌劑(B劑型)。清水中浸泡的苗為對(duì)照。種植人參苗的株距10 cm,行距30 cm。進(jìn)行正常管理。

10月中旬，取出參根調(diào)查人參成活株數(shù)、病株數(shù)、參根地徑、根長(zhǎng)、根重等(調(diào)查4行，標(biāo)準(zhǔn)株數(shù)為60株)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同拮抗菌劑室內(nèi)保存效果

2.1.1 菌劑中拮抗菌活菌數(shù)目檢測(cè)

菌劑在100 d內(nèi)活菌數(shù)目變化見圖1～3。

圖1 Y-S-Y12菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的變化趨勢(shì)Fig.1 The change trend of viable bacteria count of the Y-S-Y12

圖2 YBN13菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的變化趨勢(shì)Fig.2 The change trend of viable bacteria count of the YBN13

圖3 YBN18菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的變化趨勢(shì)Fig.3 The change trend of viable bacteria count of the YBN18

由圖1～3可知，用滑石粉、高嶺土、活性炭制作的Y-S-Y12、YBN13和YBN18菌劑中的活菌數(shù)目從第10天開始有不同程度的上升，在第40天達(dá)到頂峰，50 d以后活菌數(shù)目開始緩慢下降。在40 d時(shí)，用活性炭制作Y-S-Y12和YBN18菌劑的活菌數(shù)最多，用滑石粉制作的YBN13菌株菌劑活菌數(shù)最多。到100 d時(shí)不同菌劑中活菌數(shù)目基本趨于穩(wěn)定，并多于GB20287-2006CHB農(nóng)用微生物菌劑中要求微生物菌劑有效活菌數(shù)目應(yīng)大于2×108cfu/g的標(biāo)準(zhǔn)[16]。

2.1.2 不同菌劑對(duì)人參銹腐病菌的抑菌活性

由表1可知， Y-S-Y12 3種菌劑的抑菌率比原菌株培養(yǎng)液有下降趨勢(shì)，但Y-S-Y12 A、Y-S-Y12 B菌劑與對(duì)照之間沒有顯著性差異， Y-S-Y12 C菌劑的抑菌率顯著低于對(duì)照。YBN13 3種菌劑對(duì)人參銹腐病菌的抑菌率比原菌株有顯著下降趨勢(shì)，下降率達(dá)到了10%左右，但3種菌劑間抑菌率沒有顯著性差異。YBN18 B菌劑抑菌率顯著高于對(duì)照，YBN 18 A菌劑的抑菌率和對(duì)照之間沒有顯著性差異，YBN18 C菌劑的抑菌率顯著低于對(duì)照。

綜上所述，Y-S-Y12和YBN18 2種菌劑在活菌數(shù)目上基本達(dá)標(biāo)，并相差不大；在抑菌率上C菌劑與對(duì)照之間有顯著性差異，故Y-S-Y12菌劑和YBN18菌劑可選材料為滑石粉和高嶺土。YBN13 3種菌劑在活菌數(shù)目和抑菌效果上相差不大，故YBN13菌劑可選材料為滑石粉、高嶺土和活性炭。

表1 不同菌劑對(duì)人參銹腐病菌的抑菌活性

2.2 高效拮抗菌菌劑的田間防病試驗(yàn)

2.2.1 不同拮抗菌菌劑處理對(duì)人參銹腐病病情指標(biāo)的影響

田間病情調(diào)查結(jié)果見表2。

表2 不同拮抗菌菌劑對(duì)人參銹腐病的病情指標(biāo)的影響

對(duì)表2中的人參苗成活株數(shù)和銹腐病病株數(shù)進(jìn)行方差分析的結(jié)果表明，成活株數(shù)和病株數(shù)在區(qū)組間沒有顯著性差異，說明用滑石粉和高嶺土制作的菌劑對(duì)人參苗成活率和人參銹腐病發(fā)病率沒有影響。不同處理間成活株數(shù)和病株數(shù)之間差異均達(dá)到極顯著水平[F成活株數(shù)=107.428 6>F0.01(2,6)=10.92；F病株率=107.428 6>F0.01(2,6)=10.92]。對(duì)人參苗成活株數(shù)進(jìn)行多重比較的結(jié)果表明，Y-S-Y12、YBN13、YBN18、Y-S-Y12+ YBN13、Y-S-Y12+ YBN18菌劑處理的人參平均成活數(shù)顯著高于對(duì)照，且它們之間沒有顯著性差異，用YBN13+YBN18菌劑處理的人參的平均成活株數(shù)較少，且與對(duì)照之間沒有顯著性差異。

不同拮抗菌菌劑處理人參銹腐病病株數(shù)顯著低于對(duì)照，其中,用Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、Y-S-Y12+YBN18菌劑處理的人參銹腐病病株數(shù)最少，平均防效均達(dá)到了70%以上；其次為YBN13菌劑處理的人參銹腐病病株數(shù)，其平均防效為69.89%；再次為YBN 18菌劑；用YBN13+YBN18菌劑處理的人參銹腐病病株數(shù)最多，其平均防效僅為49.96%。

2.2.2 不同拮抗菌菌劑處理對(duì)人參產(chǎn)量指標(biāo)的影響

秋季測(cè)得的人參產(chǎn)量指標(biāo)見表3。

對(duì)表3中的人參根徑、根長(zhǎng)和根重進(jìn)行方差分析的結(jié)果，人參平均根徑、平均根長(zhǎng)和人參小區(qū)產(chǎn)量在區(qū)組間無(wú)顯著性差異，說明用高嶺土和滑石粉制作的菌劑對(duì)人參苗生長(zhǎng)指標(biāo)沒有顯著性影響。人參根莖、根長(zhǎng)及人參小區(qū)產(chǎn)量在不同處理間差異均達(dá)到了極顯著水平[F根徑=21.17>F0.01(2,6)=10.92；F根長(zhǎng)=147.63>F0.01(2,6)=42.16；F產(chǎn)量=109.42>F0.01(2,6)=10.92]。

表3 不同拮抗菌菌劑處理對(duì)人參產(chǎn)量指標(biāo)的影響

不同菌劑處理對(duì)人參根徑的影響進(jìn)行多重比較的結(jié)果表明,用高效拮抗菌菌株Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、YBN12+YBN18、YBN13菌劑處理的人參平均根徑顯著大于對(duì)照，且它們之間沒有顯著性差異；YBN13+YBN18菌劑和YBN18菌劑對(duì)人參根莖的影響不大，且與對(duì)照沒有顯著性差異。

不同菌劑處理對(duì)人參根長(zhǎng)的影響進(jìn)行多重比較結(jié)果，用菌劑Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、Y-S-Y12+YBN18、YBN13+YBN18菌劑處理的人參平均根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于對(duì)照，并且無(wú)顯著性差異； YBN13、YBN18菌劑對(duì)人參根長(zhǎng)的影響不大，并與對(duì)照之間無(wú)顯著性差異。

不同菌劑處理對(duì)人參產(chǎn)量的影響進(jìn)行多重比較結(jié)果，不同菌劑處理的人參產(chǎn)量顯著高于對(duì)照，其中用Y-S-Y12菌劑和Y-S-Y12+YBN13混合菌劑處理的人參產(chǎn)量最高，并且它們之間沒有顯著性差異；其次為YBN13、Y-S-Y12+YBN18、YBN13+YBN18菌劑,并它們之間也沒有顯著性差異。

從人參單根重上看，用菌劑YBN18菌劑處理的人參單根重少于對(duì)照外其他處理的人參單根重均高于對(duì)照，其中用菌劑Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、YBN13+YBN18菌劑處理的人參單根重大于對(duì)照，其人參單根重比對(duì)照多于115%左右。說明這幾種菌劑處理對(duì)人參根的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

微生物菌劑具有無(wú)副作用、無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，但其在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和保存過程中容易失活，從而降低生物活性。因此，如何保持菌體的活菌數(shù)和生物活性成為微生物制劑研究的主要難題。本文中采用滑石粉、高嶺土、活性炭等3種材料進(jìn)行了拮抗菌(Y-S-Y12、YBN13、YBN18)劑型化，結(jié)果菌劑中拮抗菌活菌數(shù)目100 d內(nèi)超過了GB 20287-2006(農(nóng)用微生物菌劑)[15]標(biāo)準(zhǔn)中的活菌數(shù)目要求。抑菌試驗(yàn)結(jié)果，拮抗菌菌劑制作100 d后抑菌效果并沒有顯著變化。

微生物菌劑有效性與田間防病試驗(yàn)結(jié)果有密切相關(guān)。不同菌劑處理對(duì)人參銹腐病病情指標(biāo)影響的研究結(jié)果表明，Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13和Y-S-Y12+YBN18菌劑對(duì)人參銹腐病有較高的防治效果，達(dá)到了72.04%～77.42%。本試驗(yàn)中不同菌劑處理的人參產(chǎn)量指標(biāo)顯著高于對(duì)照，其中,用Y-S-Y12菌劑和Y-S-Y12+YBN13混劑處理的人參根莖、根長(zhǎng)以及人參產(chǎn)量等指標(biāo)顯著高于其它處理。這說明，菌劑對(duì)人參的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。這與金海強(qiáng)等[16]用Y-S-Y12菌株、YBN13菌株和YBN18菌株發(fā)酵液處理人參試驗(yàn)中得到的結(jié)果基本一致。

綜合各因素的分析，單個(gè)菌劑中Y-S-Y12菌劑對(duì)人參銹腐病的防病作用及人參生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯；單劑和混劑效果上看混劑效果優(yōu)于單劑；混劑中Y-S-Y12+YBN13混劑的效果最佳。

微生物菌劑使用方法有多種，如噴霧、直接施與土壤、移栽后追施等。本文只采用了移栽前參苗浸泡在菌劑溶液中的方法，沒嘗試其它方法,對(duì)此有必要進(jìn)一步研究。

[1] 傅俊范．藥用植物病理學(xué)[M]．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007:146-148．

[2] Sunick Kim.Characteristics of occurrence and cultural,chemical control of Ginseng root rot[D].South Korea:Chungnam National University,006：5-7.

[][]

[3] Yoshida S,Hiradate S,Tsukamoto T,et a1.Antimicrobial activity of culture filtrate of Bacillusamyloliquefaciens RC-2 isolated from mulberry leaves[J].Phytopathology,2001，91:181-187

[4] 韓潤(rùn)亭,張金花,任金平.氯化苦液劑防治人參銹腐病田間藥效試驗(yàn)[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，33(4)：32-33

[5] 馬鳳茹，邢云章.棉隆防治人參銹腐病試驗(yàn)初報(bào)[J].中藥材，1985(02)：8-9

[6] 王麗華，呂瑞綿，曹戎，等.土壤消毒防治西洋參、人參土傳根病的研究[J].特產(chǎn)研究，1986(01)：17-20

[7] 周文澤.化學(xué)農(nóng)藥的“過”與“功”[J].北京農(nóng)業(yè)，2009(7)：75-77

[8] 陳曦，孫曉東，畢思遠(yuǎn)，等.東北地區(qū)人參根際土壤真菌多樣性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(10)：5515-5517，5520.

[9] 李熙英，金海強(qiáng)，賈斌.不同生長(zhǎng)年限的人參地土壤微生物多樣性研究初報(bào).延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)[J].2011,33(2)：133-136

[10] 李勇，趙東岳，丁萬(wàn)隆，等.人參內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌株的篩選[J].中國(guó)中醫(yī)藥雜志，2012,37(6)：1532-1535

[11] 姜云，尹望，陳長(zhǎng)卿，等.人參內(nèi)生菌的分離及拮抗菌株的篩選[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(3)：517-521

[12] 周如軍,傅俊范,卯婷婷,等.人參銹腐病拮抗細(xì)菌BS015最適發(fā)酵條件研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,33(3)：278-282

[13] 傅俊范，李玉娥，周如軍，等.人參銹腐病拮抗細(xì)菌HN01發(fā)酵條件優(yōu)化[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(1)：12-17

[14] 李剛,趙義濤,姜曉莉,等.EM菌對(duì)人參銹腐病的防治研究[J].特產(chǎn)研究,2001,23(2):8-9

[15] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB20287-2006農(nóng)用微生物菌劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì),2006.

[16] 金海強(qiáng)，賈斌，李熙英.楊樹腐爛病內(nèi)生拮抗細(xì)菌鑒定及防治研究[J].中國(guó)森林病蟲，2012,31(6)：1-4.

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