鴨圓環(huán)病毒檢測方法研究進(jìn)展

于新友，張 穎，李天芝

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

鴨圓環(huán)病毒病（Duck circovirus disease，DuCVD）是由鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）感染引起的一種免疫抑制性疾病[1]。各品種和日齡鴨均可感染發(fā)病，臨床表現(xiàn)為羽毛發(fā)育不良、脫落、生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率降低、消瘦和貧血等[2]。單純感染DuCV時(shí)，一般僅造成鴨零星死亡，但該病毒感染后可造成鴨免疫抑制，容易混合感染或繼發(fā)其他疾病，致鴨死亡率升高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了經(jīng)濟(jì)損失。2003年Hattermann等[3]首先報(bào)道該病，隨后世界各地均有相關(guān)報(bào)道，2006年Chen等[4]在我國臺(tái)灣地區(qū)檢測到DuCV感染，2006年姜世金等在我國大陸地區(qū)鴨群中檢測到DuCV感染。近年來，DuCV在我國鴨群中的感染及混合感染病例呈上升趨勢(shì)[5]，引起獸醫(yī)界的高度關(guān)注。

DuCV屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒粒子呈圓形或二十面體對(duì)稱，無囊膜，直徑約為15～16 nm，是目前已知最小的鴨病毒。該病毒對(duì)外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，一旦感染鴨群很難被清除，且目前尚不能在體外培養(yǎng)。DuCV是單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組長約2.0 kb，有2個(gè)主要的閱讀框ORFV1和ORFC1，分別編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白和核衣殼蛋白Cap蛋白，病毒可分為DuCV-1和DuCV-2基因型。本文對(duì)DuCV診斷方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為該病的快速診斷和防控提供參考。

1 血清學(xué)檢測方法

1.1 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）

IFA的基本原理是先用一抗處理待檢細(xì)胞，形成抗原抗體復(fù)合物，再加入熒光標(biāo)記抗體，在相應(yīng)條件下孵育，采用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測，如果發(fā)出熒光則表明有病毒粒子存在。張興曉[6]根據(jù)已發(fā)表的DuCV LY0701株Cap基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，成功擴(kuò)增出目的片段，連接表達(dá)載體pGEX-6P-1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21，成功表達(dá)出重組蛋白，將蛋白純化后免疫BALB/c小鼠，制備抗血清Ab-Cap，建立了DuCV IFA檢測方法，應(yīng)用于臨床病料檢測。結(jié)果顯示，法氏囊、肝臟和胸腺病料樣品中的病毒含量依次減少。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是指將抗原或抗體包被到特定反應(yīng)板上，利用抗原抗體結(jié)合原理，加入相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或抗體的定量或定性檢測，適合大批量樣本同時(shí)檢測，主要應(yīng)用于抗體檢測。蘇小東等[7]對(duì)鴨群進(jìn)行DuCV血清流行病學(xué)調(diào)查，用原核表達(dá)了全長DuCV Cap蛋白，表達(dá)的重組蛋白免疫原性良好，重蛋白純化后作包被抗原，應(yīng)用30份DuCV抗體陰性血清和16份DuCV抗體陽性血清，建立了檢測DuCV抗體的間接ELISA方法，用建立的方法檢測從江蘇省部分鴨場收集的陽性血清，發(fā)現(xiàn)DuCV抗體陽性率約為26.7%（38/142）。

2 分子生物學(xué)檢測方法

2.1 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，具有操作簡單、不受抗原抗體反應(yīng)的限制和結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層推廣使用。Zhang等[8]利用PCR方法擴(kuò)增出DuCV基因片段約228 bp，然后用地高辛標(biāo)記，建立斑點(diǎn)雜交方法，最小可檢測13.2 pg DuCV目的基因片段。鄒金峰等[9]用地高辛標(biāo)記DuCV全基因組克隆制成核酸探針。特異性檢測結(jié)果顯示，探針僅能與DuCV的核酸發(fā)生陽性雜交反應(yīng)，與其他常見鴨病毒病核酸均無雜交反應(yīng)；敏感性結(jié)果表明，該探針對(duì)DuCV的最低檢出量約為5 pg DuCV的DNA。

2.2 常規(guī)PCR方法

常規(guī)PCR方法是根據(jù)網(wǎng)上公開的病原基因序列，比對(duì)分析后查找保守區(qū)域部分，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，通過DNA聚合酶的作用，采用PCR儀，在體外大量擴(kuò)增目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，從而判定檢測結(jié)果，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。李志國等[10]根據(jù)DuCV-1和DuCV-2 Cap基因保守序列，分別設(shè)計(jì)2對(duì)不同的特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)擴(kuò)增條件后，建立了能同時(shí)檢測這2種不同基因型的雙重PCR檢測方法。該方法檢測的敏感性為1拷貝的DuCV DNA。對(duì)山東省6個(gè)不同鴨場收集的病料樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)鴨場中DuCV-1和DuCV-2的混合感染率為50.0%（3/6），DuCV-2單一感染率約為33.33%（2/6）。

2.3 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)

限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)即PCRRFLP技術(shù)，其基本操作是先用PCR擴(kuò)增目的基因，再將其用特定的限制性內(nèi)切酶切成大小不等的片段，通過電泳檢測基因大小，從而實(shí)現(xiàn)病毒的分類或分型檢測。萬春和等[11]根據(jù)DuCV-1和DuCV-2復(fù)制相關(guān)蛋白基因編碼區(qū)核苷酸序列特征，建立一種鑒別DuCV-1和DuCV-2的聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法。結(jié)果表明，特異性的PCR引物可同時(shí)對(duì)DuCV-1和Du CV-2進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約616 nt大小的目的片段。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ酶切后，發(fā)現(xiàn)KpnⅠ酶切DuCV-1擴(kuò)產(chǎn)物后條帶無任何變化，而DuCV-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被切成約360 nt和256 nt 2種不同大小的基因片段。

2.4 套式PCR方法

套式PCR是根據(jù)1種病原的基因保守序列，設(shè)計(jì)2對(duì)不同的引物，即外引物和內(nèi)引物，先以病原核酸為模板，用外引物進(jìn)行擴(kuò)增，再將擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用內(nèi)引物進(jìn)行第2次擴(kuò)增，從而大大提高了檢測敏感性。由于是以第1次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，因此如果第2次能成功擴(kuò)增目的基因，則表明方法具有良好的特異性。柴順秀等[12]根據(jù)GenBank發(fā)布的DuCV保守區(qū)基因組序列，設(shè)計(jì)合成內(nèi)、外2對(duì)引物，通過PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了套氏PCR檢測DuCV的方法。該法對(duì)4種其他鴨病原的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，第1輪和第2輪檢測的名感性分別為10 pg和0.1 pg，是常規(guī)PCR方法敏感性的100倍。蔡銳等[13]根據(jù)GenBank發(fā)布的DuCV序列，采用生物軟件，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，即外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)，建立了DuCV套氏PCR檢測方法。應(yīng)用建立的方法對(duì)從安徽不同鴨場采集的胸腺、肝臟、法氏囊等不同組織器官進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)套氏PCR擴(kuò)增的目的基因大小為340 bp，該方法特異性好，對(duì)正常鴨胚、健康鴨肝臟和8種常見鴨病原擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，外引物第1次擴(kuò)增檢測的敏感性為1 ng DuCV DNA，內(nèi)引物第2次擴(kuò)增檢測的敏感性為1 fg DuCV DNA，檢測敏感性是單純用外引物的106倍。

2.5 多重PCR方法

多重PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入多種引物，同時(shí)檢測2種或以上疾病，可實(shí)現(xiàn)多種疾病的快速檢測篩查，特異性好，效率高，成本低，在臨床診斷中應(yīng)用廣泛。許宗麗等[14]等根據(jù)DuCV、鴨瘟病毒和鴨源新城疫病毒基因保守序列，分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立了檢測這3種疾病的多重PCR檢測方法，對(duì)DuCV、鴨瘟病毒和鴨源新城疫病毒3種病毒核酸擴(kuò)增的目的基因大小分別為338、576和823 bp，檢測的敏感性分別為 4.67×102、1.12×103和2.59×103拷貝/μL。張艷芳等[15]針對(duì)Gen Bank中坦布蘇病毒E基因和DuCV REP基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物，通過優(yōu)化反應(yīng)體系條件及特異性和敏感性評(píng)價(jià)，建立了雙重PCR檢測DuCV和鴨坦布蘇病毒的方法。敏感性檢測結(jié)果顯示，該法對(duì)2種病毒基因組檢測敏感性均為100 fg；特異性檢測結(jié)果顯示，該方法特異性良好，對(duì)鴨常見的其他病毒，如H9亞型禽流感病毒、番鴨細(xì)小病毒、新城疫病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、番鴨呼腸孤病毒和減蛋綜合征病毒等，其核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。曹慧慧等[16]為建立能同時(shí)檢測并區(qū)分DuCV和鵝圓環(huán)病毒（Goose circovirus，GoCV）的方法，根據(jù)DuCV和GoCV基因組的保守區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，預(yù)期特異性擴(kuò)增DuCV和GoCV片段大小分別為192 和556 bp。優(yōu)化了擴(kuò)增反應(yīng)條件后，建立了DuCV和GoCV雙重PCR檢測方法。特異性檢驗(yàn)表明該方法無法擴(kuò)增其他水禽病原，DuCV和GoCV的最低檢出限分別為104拷貝/μL和105拷貝 /μL。

2.6 熒光定量PCR方法

在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的熒光定量PCR是一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)和光譜技術(shù)的特點(diǎn)，具有可實(shí)現(xiàn)定量檢測、靈敏度高和特異性強(qiáng)等多種優(yōu)點(diǎn)。熒光定量PCR方法可分為染料法和探針法2種。染料法成本低，最常用的染料是SYBR Green Ⅰ，主要原理是與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)小溝部分結(jié)核發(fā)出熒光，對(duì)引物的特異性要求非常高，否則容易產(chǎn)生假陽性，探針法成本較高，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件進(jìn)行選擇。趙光遠(yuǎn)等[17]根據(jù)DuCV保守基因，設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，建立了DuCV SYBR Green Ⅰ熒光PCR檢測方法。結(jié)果顯示，該法檢測的敏感性達(dá)到1×102拷貝標(biāo)準(zhǔn)品DNA，特異性好，與鴨瘟、H9亞型禽流感、小鵝瘟和鴨肝炎病毒等不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的重復(fù)性。許宗麗等[18]根據(jù)鴨副黏病毒（DPMV）和DuCV保守基因，設(shè)計(jì)了 2對(duì)引物和2條TaqMan探針，建立了DuCV和DPMV的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法。該方法敏感性好，對(duì)DuCV和DPMV的檢測敏感性分別達(dá)到140和160個(gè)拷貝數(shù)，該方法特異性強(qiáng)，對(duì)H9型禽流感病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒等的檢測結(jié)果均為陰性。劉玲鳳等[19]為實(shí)現(xiàn)對(duì)DuCV的快速檢測，分析比對(duì)Gen Bank發(fā)布的DuCV全基因組序列，選擇保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，建立了熒光PCR檢測DuCV的檢方法。重復(fù)性和靈敏性檢測結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好，檢測下限為67.2拷貝/μL。將建立的DuCV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法分別對(duì)鴨肝炎病毒（DHV）、大腸桿菌、新城疫病毒（NDV）、H9亞型禽流感病毒、小鵝瘟病毒（GPV）核酸或cDNA進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果表明特異性良好。

2.7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)

LAMP技術(shù)是一種在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)，只需要普通水浴鍋，不需要價(jià)格昂貴的PCR儀，操作簡便，反應(yīng)時(shí)間短，敏感性高，特異性好，適合基層應(yīng)用。趙光遠(yuǎn)等[20]根據(jù)GenBank發(fā)布的DuCV基因保守序列，應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)了6條引物，并優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序，建立了DuCV的LAMP檢測方法。該方法對(duì)H9亞型禽流感、小鵝瘟、鴨瘟、鴨肝炎和鴨副黏病毒核酸的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果均為陰性，對(duì)DuCV核酸模版的檢測敏感性為10 fg，是常規(guī)PCR方法的1 000倍，整個(gè)反應(yīng)過程可在1 h內(nèi)完成，大大提高了檢測效率。

3 小結(jié)

DuCV是一種新發(fā)病毒，其相關(guān)研究還不深入，目前尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有電鏡觀察、分子生物學(xué)診斷和間接ELISA方法。電鏡法對(duì)儀器要求高，一般實(shí)驗(yàn)室很難達(dá)到，不能廣泛應(yīng)用。間接ELISA方法雖然能處理大量樣品，但還沒有商品化的試劑盒，且鴨群感染后抗體能持續(xù)很長時(shí)間，因此，檢測抗體抗性并不能說明鴨處于發(fā)病期。分子生物學(xué)檢測針對(duì)病原檢測。因發(fā)病期鴨組織器官中含大量病毒，且能排毒，在臨床檢測中具有重要意義，所以檢測時(shí)一定要選取正確的靶器官，常選取發(fā)病初期鴨法氏囊、脾臟和肝臟等組織，需盡快將樣品送至實(shí)驗(yàn)室檢測，全程保持低溫，避免樣品腐敗變質(zhì)。分子生物檢測法種類繁多，各有利弊。探針法雖能檢測大量樣品，但操作繁瑣，常規(guī)PCR大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都能開展，但檢測敏感度低，不能定量；熒光PCR操作簡便，對(duì)儀器和人員要求高；LAMP方法檢測速度快，適合基層用，但前期研發(fā)困難，檢測容易出現(xiàn)假陽性。不同實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件選擇適合的方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新型便攜式儀器可能很快被研發(fā)出來，從而出現(xiàn)敏感性高、特異性好、價(jià)廉、可操作性強(qiáng)、適合廣泛推廣應(yīng)用的新技術(shù)，為DuCVD防控工作奠定基礎(chǔ)。

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