P301L突變tau蛋白轉基因動物模型及其應用

馬登磊，張如意，李 林

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京 100053)

微管相關蛋白tau(microtubule-associated protein tau，MAPT)是一種微管結合蛋白，在細胞中發(fā)揮生理功能。Tau蛋白的病變可以引起以高度磷酸化tau聚集為特點的多種tau蛋白病(tauopathies)，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、連鎖于17號染色體tau突變伴帕金森綜合征的額顳葉癡呆(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to tau mutations on chromosome 17，F(xiàn)TDP-17)、皮質(zhì)基底節(jié)變性等。作為AD的兩個主要病理特征之一，tau蛋白的病變與認知功能降低和神經(jīng)元丟失具有很高的相關性[1]，一些以tau蛋白為靶點的治療研究在動物模型和臨床試驗中顯示出較好的療效[2-3]，因此很多學者認為tau蛋白是治療AD的潛在有效靶點。在tau蛋白相關研究中，tau蛋白轉基因動物模型可以模擬AD及其他tau蛋白病的一些疾病特征，被廣泛應用于相關疾病的病理機制研究及藥物研發(fā)中[4-5]。隨著國內(nèi)科研水平的發(fā)展以及對tau蛋白認識的加深，基于tau蛋白轉基因動物模型的疾病機制或藥理研究已經(jīng)得到國內(nèi)多個實驗室的關注。

1 微管相關蛋白tau

1.1 結構和功能

Tau基因位于17號染色體長臂(17q21)，含有16個外顯子。在正常成人大腦中，由于mRNA在外顯子1、2、10的選擇性剪接，tau蛋白存在6種不同的異構體：4R2N、3R2N、4R1N、3R1N、4R0N、3R0N。Tau蛋白由352～441個氨基酸組成。在正常的神經(jīng)元中，tau蛋白主要富集于神經(jīng)元軸突內(nèi)，與微管結合，調(diào)節(jié)微管的組裝與解聚，維持微管的穩(wěn)定性。在異常情況下，如tau蛋白的異常磷酸化，或3R tau和4R tau的比例發(fā)生變化，會影響到tau的正常生理功能，并引起相應的神經(jīng)系統(tǒng)病理變化[6]。

1.2 Tau基因突變

Tau基因突變最早發(fā)現(xiàn)于FTDP-17患病家系中。FTDP-17，即連鎖于17號染色體伴帕金森綜合征的額顳葉癡呆，是以精神行為異常、言語不利或運動障礙為特點的癡呆綜合癥。迄今為止，已經(jīng)在17號染色體上發(fā)現(xiàn)了34個tau基因的突變，包括N279K、G272V、P301L、P301S、Q336R、V337M、R406W等[7]。不同F(xiàn)TDP-17患者的臨床特點和發(fā)病程度因為突變基因不同而各異。根據(jù)主要臨床表現(xiàn)，一類以N279K等位點的基因突變引起的帕金森綜合征為主要表現(xiàn)，一類以P301L等位點的基因突變引起的癡呆為主要臨床表現(xiàn)[8]。

P301L突變類型的FTDP-17患者以癡呆為主要的臨床表現(xiàn)，發(fā)病年齡平均為33歲，大部分患者伴有行為和人格改變(如攻擊性和自制能力下降)和語言功能的退化[9]。P301L突變位于外顯子10，全長tau編碼301位氨基酸的三個堿基中第二個C錯義突變?yōu)門，導致該部位的脯氨酸(Pro)突變?yōu)榱涟彼?Leu)。在有P301L-tau基因突變的病人中，tau的病變體主要由4R tau組成，并在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中聚集成糾纏的細絲或雙股螺旋細絲(paired helical filaments，PHFs)[10]。相對于野生型tau蛋白，P301L突變的tau蛋白更易促進tau蛋白聚合成細絲和PHFs，在體外P301L突變tau蛋白更容易被肝素或花生四烯酸誘導而聚集成細絲[11]。

2 P301L突變tau蛋白轉基因動物模型——rTg4510小鼠

目前國內(nèi)外學者已經(jīng)建立了多個表達P301L突變的tau蛋白轉基因動物模型，不同啟動子引起不同程度的tau蛋白表達和病變。其中rTg4510小鼠可以在前腦區(qū)域過表達P301L突變tau蛋白，具有明顯的tau蛋白病理表現(xiàn)。

2.1 rTg4510小鼠的構建

Santacruz等[12]構建了以鈣調(diào)蛋白激酶II(calmodulin kinase II，CaMKII)為啟動子表達P301L突變的人0N4R tau蛋白的轉基因小鼠，即rTg4510轉基因小鼠。CaMKII主要表達在前腦興奮性神經(jīng)元中，因此CaMKII作為大腦皮層和海馬神經(jīng)元特異性啟動子而廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)相關模型中。該轉基因小鼠應用了Tet-off可調(diào)控基因表達系統(tǒng)，利用大腸桿菌轉座子Tnl0四環(huán)素抗性操縱子在真核細胞中定量并特異地控制外源基因表達。該系統(tǒng)包括兩部分，其中一部分由Tet應答元件(Tet response element，TRE)和目的基因P301L突變的4R0N-tau的cDNA組成，另外一部分由CaMKII啟動子和Tet轉錄活化因子組成。在rTg4510轉基因小鼠CaMKII表達的前腦區(qū)域，Tet轉錄活化因子結合到TRE進而誘導P301L突變tau蛋白的過表達。而當轉基因小鼠暴露于Tet或其衍生物時，TRE不被激活，基因過表達處于關閉狀態(tài)。rTg4510轉基因小鼠可以由Tg(Camk2a-tTA)和Tg(tetO-MAPT*P301L)兩個轉基因小鼠交配得到，兩個轉基因系統(tǒng)均陽性的子代即過表達P301L-tau蛋白的rTg4510轉基因小鼠[13]。

2.2 rTg4510小鼠的病理表現(xiàn)

rTg4510小鼠可以在前腦區(qū)域表達13倍于內(nèi)源性tau的人P301L突變tau蛋白。免疫染色的結果顯示，rTg4510轉基因小鼠從1月齡起海馬區(qū)就出現(xiàn)tau蛋白的磷酸化和寡聚體[14-15]，2.5月齡開始出現(xiàn)tau蛋白的沉積，3月齡就出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)[16]。除了磷酸化之外，4月齡以后的tau蛋白聚集體中還存在明顯的乙?；?、泛素化和硝基化等蛋白修飾[16]。而且從2.5月齡開始，rTg4510小鼠的海馬和前腦區(qū)域就出現(xiàn)DNA的斷裂和細胞凋亡因子caspase-3的激活，進而引起caspase對tau蛋白的截斷作用，并加劇tau蛋白的病變[17-18]。除了過表達外源性tau蛋白的相關病變外，從4月齡開始小鼠內(nèi)源性tau蛋白在神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞內(nèi)出現(xiàn)異常的聚集[19]。

伴隨著磷酸化tau蛋白和神經(jīng)原纖維纏結的增多，rTg4510轉基因模型小鼠從5.5月齡開始出現(xiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的變性死亡，而9月齡以上的小鼠會出現(xiàn)大量神經(jīng)元的變性死亡[20]。此外，rTg4510小鼠還會出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的激活和神經(jīng)炎癥[21-22]，谷氨酸代謝異常和興奮性毒性[23]，線粒體缺陷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[24-25]；3月齡開始出現(xiàn)軸突運輸缺陷，突觸丟失和突觸功能紊亂[26-27]，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元興奮性降低以及皮層神經(jīng)元網(wǎng)絡活性降低等神經(jīng)電生理的變化等[28-29]。電鏡結果顯示，從4月齡起海馬CA1區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞內(nèi)就出現(xiàn)了明顯的超微結構病理表現(xiàn)[30]。在體影像學檢測顯示，rTg4510小鼠杏仁核和海馬區(qū)的神經(jīng)活動明顯減少[31]，從5.5月齡開始出現(xiàn)皮層和海馬萎縮[32]，以及tau蛋白病變引起的年齡相關的白質(zhì)受損[33]等病理表現(xiàn)。

2.3 rTg4510小鼠的行為學變化

由于明顯的tau蛋白病變及其他病理表現(xiàn)，rTg4510小鼠也在多個行為學測試中表現(xiàn)出認知能力障礙[12, 34-35]和精神狀態(tài)異常[36]。2.5月齡之后，rTg4510小鼠在Morris水迷宮試驗中表現(xiàn)出明顯的年齡相關的空間認知障礙，而在給予強力霉素(doxycycline)抑制tau蛋白的過表達后則不出現(xiàn)認知障礙。6月齡rTg4510小鼠未出現(xiàn)運動功能障礙[12]。除水迷宮外，rTg4510小鼠在條件恐懼性試驗[36]和Barnes迷宮試驗[35]中均顯示認知能力的障礙。此外，在曠場試驗和高架十字迷宮試驗中rTg4510小鼠也表現(xiàn)出了精神異常，這些異?？赡芘ctau病變引起杏仁核受損有關[36]。另外，5.5月齡雌性rTg4510小鼠的認知障礙程度比同月齡的雄性轉基因小鼠嚴重，其原因可能與雌性小鼠中tau蛋白磷酸化等病理表現(xiàn)更為嚴重有關[37]。

3 rTg4510小鼠模型的應用

由于rTg4510小鼠表現(xiàn)出明顯的tau蛋白相關的病變，因此已用于tau蛋白病的發(fā)病機制和治療靶點的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，rTg4510小鼠腦內(nèi)tau蛋白寡聚體的含量和可溶性磷酸化tau蛋白的表達增高與該小鼠認知能力的降低呈明顯的相關性[16, 38]，而含有神經(jīng)纖維纏結的神經(jīng)元仍能夠發(fā)揮生理功能[39]。此外，有報告應用該模型小鼠研究Aβ寡聚體與tau蛋白病變的關系[40]、caspase剪切的tau蛋白與神經(jīng)原纖維纏結形成的關系[41]等，為發(fā)現(xiàn)新的發(fā)病機制和干預靶點提供實驗依據(jù)。

另外，rTg4510轉基因小鼠也用于AD及其他tau蛋白病治療藥物的研究，包括：

(1)Tau蛋白的免疫療法：有研究給予rTg4510小鼠tau蛋白引發(fā)主動免疫，可以降低腦內(nèi)tau蛋白的含量和神經(jīng)炎癥[42]。側腦室注射tau蛋白構象相關抗體MC1后，rTg4510小鼠的tau蛋白病理表現(xiàn)以及認知障礙得到改善[43]。有研究者發(fā)現(xiàn)，抗磷酸化tau蛋白抗體可以降低rTg4510小鼠腦內(nèi)和腦脊液中磷酸化tau蛋白的含量[44]。

(2)降低tau蛋白磷酸化：給予GSK2606414(蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶抑制劑)能夠降低rTg4510小鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平，保護神經(jīng)元[45]。藥物治療rTg4510小鼠可通過提高tau蛋白的糖基化水平而降低病變tau蛋白的異常聚集和腦脊液中tau蛋白的水平，保護神經(jīng)元[46-47]。

(3)促進tau蛋白清除，抑制tau蛋白聚集：轉錄因子EB(TFEB)能夠特異性地識別磷酸化和錯誤折疊的tau蛋白，從而通過激活自噬-溶酶體途徑促進tau蛋白的清除進而抑制tau的聚集[48]。組蛋白脫乙酰基酶6(HDAC6)抑制劑治療可以改善rTg4510小鼠的學習記憶功能，降低tau蛋白的含量，其機制可能與增強微管的穩(wěn)定性、促進熱休克蛋白HSP90降解tau蛋白有關[49]。

(4)抑制神經(jīng)炎癥：趨化因子fractalkine過表達可以抑制rTg4510小鼠腦內(nèi)tau蛋白病變，降低小膠質(zhì)細胞激活[50]。纖維素肽段連接的Fe2O3納米粒治療老年rTg4510小鼠可以抑制小膠質(zhì)細胞的激活，降低含有tau蛋白病變的神經(jīng)元數(shù)量，顯示了年齡依賴性的藥理作用[51]。

(5)其他：利魯唑通過改善rTg4510小鼠腦內(nèi)谷氨酸的變化可以減輕tau蛋白的病理表現(xiàn)，提高小鼠的認知功能[52]?；腔郊姿嵫苌顰K1通過抑制sirtuin 2可以減輕rTg4510小鼠神經(jīng)退行性病變，顯示神經(jīng)保護作用[53]。微管穩(wěn)定劑BMS-241027能夠改善rTg4510小鼠的微管異常、病理改變和認知功能障礙[54]。煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶2(NMNAT2)過表達能夠拮抗rTg4510小鼠腦中環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB蛋白)活性和nmnat2轉錄在tau病變中的下調(diào)，顯示神經(jīng)保護作用[55]。

4 其他P301L突變tau蛋白轉基因動物模型

除了rTg4510轉基因小鼠外，還有多個轉基因小鼠過表達P301L突變tau蛋白。應用比較廣泛的有JNPL3轉基因小鼠，以鼠PrP為啟動子，在皮層、腦干和脊髓等部位過表達人源0N4R P301L-tau蛋白，表達量為內(nèi)源性tau蛋白的兩倍。JNPL3轉基因小鼠隨著年齡的增加，出現(xiàn)高度磷酸化tau蛋白的聚集，4.5月齡出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結和內(nèi)涵體，進一步引起軸突的退行性病變和空泡樣髓鞘病變等，進而導致小鼠的認知功能障礙[56]。此外，老年JNPL3轉基因小鼠的脊髓中還出現(xiàn)進行性的髓鞘脫失等白質(zhì)病變，從而引起該模型小鼠的運動功能障礙[57]。

還有以鼠Thy1.2為啟動子表達人P301L突變2N4R tau的轉基因小鼠pR5，在神經(jīng)系統(tǒng)過表達P301L-tau蛋白[58]。pR5轉基因小鼠顯示年齡相關的tau蛋白磷酸化和聚集，膠質(zhì)細胞激活和線粒體功能紊亂，在6月齡時出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結，并顯示空間認知障礙[59]。轉基因小鼠Tau-4R-P301L以鼠Thy-1為啟動子，在皮層、海馬和脊髓表達4倍于內(nèi)源性tau的人源P301L-tau蛋白，引起tau相關的病變，并在老年轉基因小鼠中表現(xiàn)出認知功能障礙[60]。王艷艷等利用雄原核纖維注射法制備了以Thy-1為啟動子的P301L-tau轉基因鼠，該小鼠模型腦內(nèi)tau蛋白表達量增加，并出現(xiàn)空間認知障礙[61]。除此之外，P301L還與其他基因共同構建多轉基因動物模型，如3×Tg轉基因擬AD小鼠[62]等。

目前已經(jīng)建立的P301L轉基因小鼠，根據(jù)啟動子不同，P301L突變tau的異構體不同而在發(fā)病進程及程度上有一定的差異。而rTg4510轉基因小鼠的主要優(yōu)勢在于，P301L-tau蛋白的過表達量較高，因此發(fā)病進程較快，并且tau相關病變程度明顯。另外大部分P301L轉基因小鼠會出現(xiàn)運動相關障礙，而rTg4510小鼠的運動能力未出現(xiàn)明顯的降低。

5 結語

目前已經(jīng)構建了多個P301L突變tau蛋白轉基因小鼠模型，并廣泛應用于AD及其他tau蛋白病的病理機制和藥物研究中。rTg4510轉基因小鼠作為在前腦和海馬中過表達P301L突變tau蛋白的轉基因小鼠，可以引起包括tau蛋白磷酸化等在內(nèi)的病理表現(xiàn)和認知功能障礙等行為異常。但是目前在應用過程中仍舊存在某些問題，例如rTg4510小鼠表達外源性tau蛋白的含量為內(nèi)源性tau的13倍，因此主要的病理表現(xiàn)來自于過量tau表達引起的相關病變。對于研究阿爾茨海默病等tau蛋白病來說，該模型并不能完全模擬人體內(nèi)復雜的疾病過程。此外，某一種疾病模型只是過表達tau蛋白的某一個異構體，而在人體tau蛋白是有多個異構體存在。盡管如此，P301L轉基因小鼠仍然在tau蛋白病的機制研究和藥物研究中發(fā)揮了重要的作用，對于AD等tau蛋白病的新藥研發(fā)具有重要意義。

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