肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機(jī)制的研究近況

倪珊珊,孫紅妹

肺炎支原體是柔膜體綱的一種非典型病原體,是社區(qū)獲得性肺炎的重要致病原,肺炎支原體肺炎約占社區(qū)獲得性肺炎的10%～30%[1-2].肺炎支原體感染在世界范圍廣泛存在,3～7年出現(xiàn)一次地區(qū)性流行,持續(xù)1～2年,其余時(shí)間呈現(xiàn)散在發(fā)病的特點(diǎn)[3].肺炎支原體經(jīng)飛沫傳播長(zhǎng)期密切接觸才能導(dǎo)致感染,潛伏期長(zhǎng),約2～3周.除肺炎外,肺炎支原體還能夠引起上呼吸道感染、支氣管炎、支氣管哮喘、肺膿瘍以及多系統(tǒng)肺外并發(fā)癥.我國(guó)兒童肺外并發(fā)部位在神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、皮膚、肌肉、關(guān)節(jié)、消化系統(tǒng);青年人的肺外并發(fā)癥則存在于循環(huán)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚黏膜等.肺炎支原體缺乏細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),因而應(yīng)用四環(huán)素和氟喹諾酮類抗生素可有效治療成人感染[4].鑒于以上兩種藥物對(duì)牙齒、骨骼的不良反應(yīng),兒童肺炎支原體感染首選大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[5].

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是多種放線菌屬細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其主要結(jié)構(gòu)是以1個(gè)大環(huán)內(nèi)酯母核通過羥基,以糖苷鍵和糖分子連接;按其內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)含碳母核的不同,可分為12元環(huán)、14元環(huán)、15元環(huán)、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯.臨床上常用的14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物有紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、地紅霉素;15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物是阿奇霉素,它在15元內(nèi)酯環(huán)上有一個(gè)甲基取代的氮,是一個(gè)氮雜內(nèi)酯類抗生素[6];16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物有螺旋霉素、交沙霉素、麥迪霉素、吉他霉素、乙酰螺旋霉素[7].

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抑菌具體機(jī)制如下:

抗生素結(jié)合于核糖體50S亞基轉(zhuǎn)肽酶中心與肽輸出通道之間的狹窄部分,通過機(jī)械性阻塞通道而抑制肽的延伸,導(dǎo)致肽酰t RNA從核糖體解離,從而阻礙肽的合成[8].抗生素抑制核糖體50S亞基的組裝,導(dǎo)致有功能的核糖體數(shù)量下降,致使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成能力下降,抑制細(xì)菌生長(zhǎng).目前具體結(jié)合位點(diǎn)尚不清楚[9].

1953年大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物應(yīng)用后,肺炎支原體耐藥現(xiàn)象在世界各國(guó)先后出現(xiàn).我國(guó)自2005年分離出肺炎支原體耐藥株后,耐藥率從2005年的16.7%逐步增加[10],至2007－2012年達(dá)到高峰,基本在95%以上[3,10-11].此后耐藥率略有下降,滑落至66%～84%[12].日本耐藥率在2000－2006年保持在5%～31.9%的低水平[13-14],2008年起逐漸增加,至2012年達(dá)到峰值約80%[15-16],而后逐年下降至43.6%.美國(guó)自1991年至今一直保持較低的耐藥率,大致在3%～16.7%范圍內(nèi)[17-18].

如果患者感染了耐藥型肺炎支原體,將經(jīng)歷更長(zhǎng)的發(fā)熱時(shí)間、更久的住院時(shí)間、C反應(yīng)蛋白水平上升,以及更大概率的抗生素治療方案改變[19]和更高的并發(fā)癥發(fā)生率[12].因此進(jìn)一步了解肺炎支原體的耐藥機(jī)制,降低肺炎支原體耐藥率,對(duì)患者的治療是有益的.

1 大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥機(jī)制

1.1 轉(zhuǎn)肽酶環(huán)的突變 細(xì)菌核糖體50S大亞基的23S r RNA與抗生素耐藥相關(guān)[20],突變位點(diǎn)在轉(zhuǎn)肽酶環(huán)2 059到2 617之間550 bp[21].

Lucier[22]通過核糖體結(jié)合試驗(yàn)和對(duì)核糖體序列檢測(cè)證實(shí),14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯與核糖體的結(jié)合位點(diǎn)位于肺炎支原體23S r RNA上的第2063、2064、2607、2 611位點(diǎn).15元環(huán)、16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯與14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯的結(jié)合位點(diǎn)大致相同,為23S r RNA的2062、2063、2064、2607和2616[23-24].以上這些結(jié)合位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性,將造成核糖體親和力降低,致使大環(huán)內(nèi)酯分子到核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶環(huán)的附著無效[21].

A2063G、A2064G突變產(chǎn)生高水平大環(huán)內(nèi)酯耐藥,MIC分別為≥128 mg/m L、≥256 mg/m L;A2063T突變產(chǎn)生中水平紅霉素耐藥,MIC為32 mg/m L[21];A2067G、C2617G、C2617A 突變產(chǎn)生低水平大環(huán)內(nèi)酯耐藥.

趙漢青等[25]檢測(cè)中國(guó)北京2007－2012年肺炎支原體感染標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)耐藥肺炎支原體在23S r RNA基因V結(jié)構(gòu)域的A2063G突變比例為89.92%.孫紅妹等[26]進(jìn)一步檢測(cè)了中國(guó)北京2003－2015年肺炎支原體感染標(biāo)本,A2063突變比例為99.3%.Ma Z等[27]檢測(cè)中國(guó)深圳肺炎支原體感染標(biāo)本,A2063G突變比例為63%.Kogoj等[28]檢測(cè)斯洛文尼亞中部的耐藥肺炎支原體,認(rèn)同A2063G突變最為普遍,其次為A2063C、A2063T、A2067G、C2617G、C2617A突變.Loo等[29]檢測(cè)新加坡肺炎支原體感染患兒標(biāo)本,認(rèn)同A2063G突變最常見.故目前全球耐藥肺炎支原體的最常見突變是A2063G突變.

Cao B等[30]歸納2000－2015年國(guó)內(nèi)外20余篇肺炎支原體耐藥相關(guān)綜述,總結(jié)點(diǎn)突變頻率大小順序?yàn)?A2063G、A2064G、A2063T、A2063C、A1290G、C2617A、A2067G.

23S r RNA上的點(diǎn)突變頻率在不同時(shí)期有所變化.Suzuki Y等[31]通過檢測(cè)日本山形2004－2013年的肺炎支原體標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)A2063T突變?cè)?009年頻率增加,A2063G突變頻率于2010年增加.因此仍需要繼續(xù)追蹤耐藥肺炎支原體的突變位點(diǎn)情況.

1.2 核糖體蛋白的突變 核糖體蛋白L4、L22位于核糖體50S大亞基肽流出通道,表面有球形結(jié)構(gòu)域和細(xì)長(zhǎng)觸手.后者伸入核糖體核心,作為肽流出通道的內(nèi)壁[32].L4、L22在大亞基早期組裝過程中起＂腳手架＂的作用.

根據(jù)大腸桿菌誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)可知,L4或L22突變引起的隧道變化可以傳送至肽基轉(zhuǎn)移酶中心(PTC)區(qū)域影響肽延伸率[32].具體機(jī)制為L(zhǎng)4突變減少肽基轉(zhuǎn)移酶活性,增加移碼、錯(cuò)譯、終止密碼子跨越的概率[33],縮小肽流出通道,導(dǎo)致紅霉素不能進(jìn)入其中與作用靶點(diǎn)結(jié)合[34].L22蛋白的具體機(jī)制尚不明確,仍需探索.

Pereyre[23]報(bào)告L4、L22氨基酸突變可在體外誘導(dǎo),表現(xiàn)為L(zhǎng)4蛋白的H70R、H70L替換,60位點(diǎn)1－3個(gè)甘氨酸插入;L22的P112R、A114T替換或者111IPRA114刪除.

Matsuoka[35]在耐藥株發(fā)現(xiàn)了L22蛋白的C62A突變.

辛德莉等[36]在肺炎支原體敏感株中也檢測(cè)到了L4蛋白的H70L替換(即A209T),認(rèn)為其與耐藥無關(guān);與耐藥相關(guān)的突變是L4蛋白的C58A、G81T突變和L22蛋白的C62A、T65A突變.

唐愈菲[37]用次抑菌濃度的大環(huán)內(nèi)酯誘導(dǎo)10株肺炎支原體敏感株耐藥,1株紅霉素誘導(dǎo)耐藥株存在核糖體L4蛋白A209T突變.

因此,L4蛋白的H70L替換(即A209T)是否與耐藥相關(guān),需要進(jìn)一步研究證實(shí).

2 核糖體靶點(diǎn)修飾

ermB基因編碼核糖體基化酶,后者使肺炎支原體的23S r RNA A205二甲基化,導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類抗生素失去對(duì)肺炎支原體的抑制作用.這類肺炎支原體表現(xiàn)為高水平耐藥[38].鄭定容等[39]對(duì)耐羅紅霉素的肺炎支原體進(jìn)行基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)erm B基因的陽性率93.3%(70/75例),認(rèn)為ermB基因介導(dǎo)的靶位改變是肺炎支原體對(duì)羅紅霉素耐藥的機(jī)制.

靶點(diǎn)修飾在其他細(xì)菌中已有報(bào)道,但在肺炎支原體少見,需要進(jìn)一步擴(kuò)大肺炎支原體erm基因檢測(cè)的樣本量,并增加多地區(qū)檢測(cè).

3 針對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的主動(dòng)外排機(jī)制

肺炎支原體細(xì)胞膜成分改變,出現(xiàn)將藥物主動(dòng)外排、阻止藥物作用于靶部位的膜蛋白,由外膜通道蛋白、融合蛋白和胞質(zhì)膜外排蛋白組成.該機(jī)制通過降低細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度,降低抗生素的抑菌作用.

苑鑫等[40]對(duì)耐大環(huán)內(nèi)酯的肺炎支原體測(cè)序,檢測(cè)出了外排泵msr A/B基因.該基因與屎腸球菌TX2465獲得的耐大環(huán)內(nèi)酯類基因具有高度相似性,產(chǎn)生MS表型耐藥[41].并提出外排泵msr A/B基因可能與耐藥有關(guān).

李少麗等[42]對(duì)臨床分離株測(cè)序發(fā)現(xiàn)4個(gè)非同義突變SNPs聚集于mac B基因,該基因編碼大環(huán)內(nèi)酯特殊外排泵蛋白-ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)家族.應(yīng)用外排泵抑制劑,利血平和羰基氰化物間氯苯腙,可以降低肺炎支原體的MIC值,在肺炎支原體的某些菌株甚至可使其MIC值恢復(fù)至敏感菌株水平.因而認(rèn)為mac B基因編碼的流出泵蛋白與耐藥相關(guān).

鄭定容等[39]對(duì)耐羅紅霉素的肺炎支原體進(jìn)行了基因檢測(cè),外排泵膜相關(guān)蛋白mef A、mef E的陽性率分別為 20.5%(15/75例)、45.3%(34/75例).他認(rèn)為mef基因介導(dǎo)外排機(jī)制在耐藥株中也占一定比例.

主動(dòng)外排產(chǎn)生耐藥的非專一性特點(diǎn),致使具有這種耐藥機(jī)制的細(xì)菌對(duì)不同結(jié)構(gòu)類別或不同作用機(jī)制的抗菌藥物都能產(chǎn)生耐藥性.臨床應(yīng)對(duì)主動(dòng)外排耐藥機(jī)制的細(xì)菌所引起的感染尚未取得很大的進(jìn)展,仍需要對(duì)以上幾種外排泵蛋白基因作進(jìn)一步的研究.

4 酶性失活

細(xì)菌產(chǎn)生的鈍化酶或水解酶,可以破壞大環(huán)內(nèi)酯類抗生素原有結(jié)構(gòu),使其失去活性,最終導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[43].這些病原菌內(nèi)的鈍化酶或水解酶基因可能來源于抗生素產(chǎn)生菌,后者以此保護(hù)產(chǎn)生菌自身免遭殺害.

具體機(jī)制分別是:

大環(huán)內(nèi)酯2′-磷酸轉(zhuǎn)移酶可將ATP上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到大環(huán)內(nèi)酯上的2′-OH[44].

大環(huán)內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶可將大環(huán)內(nèi)酯的6-脫氧己糖2′-OH糖基化[45].

紅霉素酯酶可將紅霉素的內(nèi)酯環(huán)水解[46],似乎專一性地作用于14元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素.

綜上,肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥,主要由于抗生素作用靶點(diǎn)突變、抗生素作用靶點(diǎn)修飾、主動(dòng)外排蛋白和酶性失活.抗生素作用靶點(diǎn)分為轉(zhuǎn)肽酶環(huán)和核糖體蛋白兩類.轉(zhuǎn)肽酶環(huán)上的突變以A2063G最為常見,其余突變位點(diǎn)因地區(qū)、年份等因素在耐藥株中比例有所不同,需要進(jìn)一步監(jiān)測(cè)以完善認(rèn)知.核糖體L4蛋白的H70L替換(即A209T)是否與耐藥相關(guān)存在爭(zhēng)議,需要進(jìn)一步證實(shí).L22蛋白突變?cè)斐赡退幍木唧w機(jī)制尚不明確,還需要進(jìn)一步探究.靶點(diǎn)修飾在其他細(xì)菌中已有報(bào)道,但在肺炎支原體少見,需要進(jìn)一步擴(kuò)大肺炎支原體erm基因檢測(cè)的樣本量,并增加多地區(qū)檢測(cè).耐藥相關(guān)的主動(dòng)外排基因有msr A/B、macB、mef,除進(jìn)一步探究耐藥機(jī)理外,也需要進(jìn)一步檢測(cè)有無新的主動(dòng)外排基因.酶性失活即細(xì)菌內(nèi)存在鈍化酶或水解酶基因,產(chǎn)生破壞藥物結(jié)構(gòu)的酶,導(dǎo)致耐藥.如何失活、拮抗這類酶是抗菌藥物新的方向.

除了上述4大類耐藥機(jī)制外,文獻(xiàn)報(bào)道中也可以看到由于藥物吸收速度降低或是改變轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等耐藥機(jī)制.從臨床分離到的耐藥菌往往具備多種耐藥機(jī)制,治療愈趨困難.因此,肺炎支原體耐藥機(jī)制的研究需要更加深入,以便支持臨床合理用藥選擇,延緩耐藥菌株出現(xiàn),減少患者痛苦,助力健康中國(guó)戰(zhàn)略.