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    基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的單堿基基因編輯技術(shù)及其在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

    2018-01-21 15:59:28張愛霞陳志國
    關(guān)鍵詞:脫氨酶堿基基因組

    張愛霞,趙 宇,安 靜,羅 影,陳志國

    (1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心,北京 100053;2.北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷和修復(fù)所,北京 100053;3.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東 梅州 514015)

    成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)基因(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated genes,CRISPR/Cas)系統(tǒng)是細(xì)菌或古細(xì)菌用來抵御外來噬菌體、質(zhì)?;蚱渌苿釉秩镜墨@得性免疫防御體系[1-4]。CRISPR/Cas9屬于CRISPR/Cas蛋白家族中的Ⅱ型,構(gòu)成簡單,主要有Cas9蛋白、特異性CRISPR RNA(crRNA)及反式激活 crRNA(transactivating crRNA,tracrRNA)組成[5]。目前使用的 CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)是用人工設(shè)計的單鏈向?qū)NA(single guide RNA,sgRNA)對tracrRNA-crRNA復(fù)合物進行了替換,使該系統(tǒng)只包含sgRNA和Cas9核酸內(nèi)切酶2個元件[6],使設(shè)計過程更加簡便。經(jīng)過人工改造后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其操作簡便、作用高效而廣泛應(yīng)用于基因治療、作物育種、疾病模型構(gòu)建及功能基因組研究等領(lǐng)域,成為最熱門的基因組編輯工具[7-11]。在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中,sgRNA能與靶序列的堿基互補配對,Cas9蛋白作為核酸酶能切割雙鏈DNA,靶序列3′端的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adja?cent motif,PAM)為Cas9的DNA識別位點,sgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物后,通過sgRNA與靶序列的配對和Cas9蛋白對PAM的識別,該RNA-蛋白復(fù)合物精準(zhǔn)地靶向特異的DNA位點,激活Cas9的核酸酶活性,切割靶DNA,產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand breaks,DSB)[12-13]。DSB的產(chǎn)生將激活細(xì)胞內(nèi)部的DNA損傷修復(fù)機制,主要的修復(fù)機制有2種:同源重組(homology-directed repair,HDR)和非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ),以NHEJ為主,這會造成基因組編輯位點的堿基產(chǎn)生插入/缺失突變[14-16]。通過引入外源基因片段作為修復(fù)模板[17]和抑制NHEJ[18-20]雖可以提高HDR的編輯效率,但在靶位點精確矯正點突變,HDR的效率仍然較低(0.1%~5%)[13,21]。除此之外,由于DSB的產(chǎn)生,不可避免地激活細(xì)胞內(nèi)NHEJ修復(fù)機制,導(dǎo)致靶位點處出現(xiàn)非預(yù)期的堿基改變,而且該系統(tǒng)可能會產(chǎn)生脫靶效應(yīng),在非靶位點誘發(fā)DSB而產(chǎn)生插入/缺失突變[15,22]。如何能在不產(chǎn)生DSB的情況下進行精確的基因組編輯成為亟待解決的技術(shù)難題。

    1 單堿基基因編輯技術(shù)概況及其優(yōu)化

    針對上述技術(shù)瓶頸,美國哈佛大學(xué)David LIU實驗室于2016年4月和2017年10月在Nature雜志上分別首次報道了基于CRISPR/Cas9的胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)[23]和新型腺嘌呤單堿基基因編輯技術(shù)[24],該技術(shù)首次實現(xiàn)了不依賴DNA雙鏈斷裂而能夠?qū)NA 4種堿基A,T,G和C進行替換,開啟了單堿基基因組編輯的新紀(jì)元。

    1.1 胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)

    胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)能在一定的編輯窗口內(nèi)實現(xiàn)堿基C到T的單堿基轉(zhuǎn)換,也稱之為單堿基編輯器(base editor,BE)。David LIU實驗室共研發(fā)了4代BE系統(tǒng),即BE1-BE4,其核心組成主要由sgRNA和Cas9蛋白和胞苷脫氨酶組成,其中Cas9蛋白和胞苷脫氨酶為融合蛋白。該系統(tǒng)中使用的胞苷脫氨酶有大鼠的APOBEC1、七鰓鰻來源的胞苷脫氨酶(petromyzon marinus cytidine deami?nase1,PmCDA1)以及人源的激活誘導(dǎo)性胞苷脫氨酶(activation induced cytidine deaminase,AID);使用的Cas9蛋白來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenesCas9,SpCas9)和金黃色葡萄球菌(Staph?ylococcus aureusCas9,SaCas9)。SaCas9的BE系統(tǒng)習(xí)慣稱為SaBE,在單堿基基因編輯系統(tǒng)中Cas9蛋白使用的是Cas9突變體,即dCas9和Cas9n(D10A)。dCas9無核酸內(nèi)切酶活性,進行DNA編輯時不切割靶DNA,不會產(chǎn)生DNA斷裂,而Cas9n(D10A)是在dCas9的基礎(chǔ)上,恢復(fù)了其在HNH結(jié)構(gòu)域的催化堿基。因此,Cas9n(D10A)有單鏈DNA切口酶活性,在進行DNA編輯時會在1條DNA單鏈上切割而產(chǎn)生切口。由于Cas9n(D10A)和dCas9仍保持與sgRNA結(jié)合的能力,但均不會引起DSB,從而有效抑制了由NHEJ介導(dǎo)的插入/缺失突變的發(fā)生。BE進行基因編輯時,通過sgRNA與靶位點序列互補配對和Cas9蛋白對PAM的識別,融合蛋白結(jié)合并識別靶位點,胞苷脫氨酶能夠?qū)⒎腔パa鏈中編輯窗口內(nèi)的堿基C脫氨基而轉(zhuǎn)變?yōu)閴A基U,而U可以在隨后的復(fù)制過程中被DNA聚合酶識別為T,從而實現(xiàn)DNA中C→T(或者G→A)的轉(zhuǎn)變?;诖硕a(chǎn)生了第1代BE,即rAPO?BEC1-XTEN-dCas9。但EB1在細(xì)胞內(nèi)的編輯效率很低,僅0.8%~7.7%,比細(xì)胞外編輯效率降低了80%~97.2%,原因是細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機制影響了堿基編輯的U∶G配對產(chǎn)物。在細(xì)胞中,尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UDG)能催化U從DNA鏈上移除,并且啟動堿基切除修復(fù)(base-excision repair,BER)。通常修復(fù)的結(jié)果是將U∶G堿基修復(fù)為C∶G堿基,從而使得編輯效率大幅下降,這是第1代BE存在的主要問題。為了抑制UDG的作用,在Cas9蛋白和胞苷脫氨酶融合蛋白后又融合了尿嘧啶DNA糖基化酶抑制因子(uracil DNA glycosylase inhibitor,UGI)。UGI是一種來自枯草芽孢桿菌噬菌體PBS2的含有83個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),可以抑制UDG活性,從而提高了BE的單堿基編輯效率。由此產(chǎn)生了BE2,即rAPO?BEC-XTEN-dCas9-UGI,BE2的編輯效率比BE1提高3倍,提高至20%。為了促進細(xì)胞內(nèi)啟動以編輯鏈為模板合成新DNA鏈的修復(fù)機制從而進一步提高編輯效率,研究者開發(fā)了第3代BE,即用Cas9n(D10A)替換了dCas9。Cas9n(D10A)可將包含G堿基的非編輯鏈(單鏈)切斷,通過誘導(dǎo)DNA錯配修復(fù)(mismatch repair,MMR),使BE3 rAPO?BEC-XTEN-Cas9n-UGI的編輯效率提高至約37%且脫靶效率顯著下降,而且不同來源的胞嘧啶脫氨酶組成的BE3和使用SaCas9突變體的SaBE3同樣具有較高的編輯效率。雖然第3代單堿基編輯系統(tǒng)的編輯效果得到很大改善,但編輯的產(chǎn)物純度仍不盡人意,即C∶G堿基對不僅會被編輯成T∶A,同時也會被編輯成G∶C或者A∶T。這種情況在編輯窗口中只存在一個堿基C時更加明顯,這主要是由于UDG和DNA無嘌呤或無嘧啶位點(apurinic or apyrimidinic site,AP)裂合酶的作用導(dǎo)致的。AP裂合酶是一種BER酶,可以將AP轉(zhuǎn)變成單鏈DNA缺口。由于UDG催化U從DNA鏈上移除將會造成AP位點,被AP裂合酶識別從而斷裂DNA,加之Cas9n(D10A)將包含G堿基的非編輯鏈(單鏈)切斷,從而造成DSB,造成細(xì)胞的錯誤修復(fù)。為了進一步減少UDG對堿基U的接觸,研究者將UGI增加到2個拷貝,即成為rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI-UGI,稱為第4代BE。BE4比BE3 rAPOBECXTEN-Cas9n-UGI的編輯效率提高約1.5倍,非T產(chǎn)物降低約52.2%,插入/缺失突變率降低約52.2%,顯著提高了編輯產(chǎn)物的純度和編輯效率。由于UDG和AP裂合酶的作用能產(chǎn)生DSB,在BE3和BE4的產(chǎn)物中也存在一定的插入/缺失突變。一種來自噬菌體Mu的蛋白質(zhì)Gam可以結(jié)合在DSB位點的末端起到保護作用,所以研究者在BE3,SaBE3,BE4和SaBE4中融入Gam蛋白,均有效降低了插入/缺失突變的發(fā)生[23,25-27]。

    除David LIU實驗室之外,日本神戶大學(xué)Akihiko Kondo實驗室于2016年8月在Science雜志上也報道了胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)[28]。該實驗室將七鰓鰻的胞苷脫氨酶與SpCas9的突變體和UGI融合,開發(fā)了dCas9-PmCDA1-UGI和Cas9n-PmCDA1-UGI單堿基基因編輯系統(tǒng)。同年10月,上海交通大學(xué)常興課題組[29]把核酸酶缺陷的Cas9蛋白和誘導(dǎo)抗體高頻突變的人胞苷脫氨酶AID融合,開發(fā)了dCas9-AIDx單堿基編輯系統(tǒng):在一種UDG抑制因子的輔助下,dCas9-AIDx可以誘導(dǎo)特定的堿基C向T轉(zhuǎn)變,實現(xiàn)單堿基的精準(zhǔn)編輯。隨后報道的CRISPR-X也使用了dCas9和AID突變體,與常興課題組的單堿基編輯系統(tǒng)有相似作用[30]。

    1.2 腺嘌呤單堿基基因編輯技術(shù)

    胞嘧啶單堿基基因編輯技術(shù)能利用胞苷脫氨酶將C∶G堿基對轉(zhuǎn)換成T∶A堿基對,如果將胞苷脫氨酶換成腺苷脫氨酶,理論上可以實現(xiàn)A∶T堿基對轉(zhuǎn)換成G:C堿基對。但是,已發(fā)現(xiàn)的天然腺苷脫氨酶,比如大腸桿菌的TadA[31-32]、人ADAR2[33]、小鼠ADA[34]和人 ADAT2[35],僅作用于游離的腺嘌呤、腺苷、RNA中的腺苷或者錯配的RNA∶DNA異聚體,不能催化DNA鏈上的堿基A脫氨基[36]。因此,人工創(chuàng)造出能催化DNA鏈上的A堿基脫氨基成為此技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

    David LIU實驗室率先實現(xiàn)了上述突破,他們選擇與APOBEC酶同源的大腸桿菌TadA酶作為改造對象。該酶作用于tRNA單鏈反密碼子環(huán),無需小分子激活劑即能催化tRNA上的堿基A脫氨基。將該酶與dCas9融合構(gòu)建了TadA-dCas9的隨機突變(突變位點在TadA)質(zhì)粒文庫,將細(xì)菌中抗生素抗性基因的關(guān)鍵位點突變成A∶T從而使抗性失效,細(xì)菌在抗生素環(huán)境中無法存活。只有具備DNA堿基編輯能力的突變TadA-dCas9的存在,在sgRNA的引導(dǎo)下,將突變的A∶T修復(fù)成G∶C后才能使細(xì)菌重新獲得抗性而存活。通過細(xì)菌對TadA酶的定向進化和蛋白質(zhì)工程手段,經(jīng)過7輪選擇優(yōu)化,David LIU實驗室成功獲得了將A∶T堿基對轉(zhuǎn)換成G∶C堿基對的腺嘌呤單堿基編輯器(adenine base editor,ABE),其中ABE7.10的編輯效率達到(58±4.0)%[24]。

    ABE系統(tǒng)能將編輯窗口內(nèi)的A堿基脫氨基而轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤?,肌苷被?dāng)成G進行讀碼與復(fù)制,從而實現(xiàn)編輯窗口內(nèi)A到G的突變。ABE7.10的編輯窗口大概包含4~6個核苷酸,目標(biāo)堿基A在原型間隔序列(protospacer)上第4~7堿基位置,PAM在第21~23堿基位置。將檢測目標(biāo)DNA位點由6個增加到17個,ABE7.10的編輯效率仍然達到(53±3.7)%,顯著高于經(jīng)典BE3對C∶G至 T∶A的編輯效率[1],具有更低的靶位點非A→G突變和插入/缺失突變的產(chǎn)生(≤0.1%),而且脫靶率也很低[24]。

    中國科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心的朱健康研究團隊[37]使用SaCas9與突變的TadA酶融合,開發(fā)了ABEP2,在某些位點的編輯效率可達61.3%,而且精確性也很高。

    1.3 單堿基基因編輯技術(shù)的優(yōu)化

    BE系統(tǒng)中胞苷脫氨酶rAPOBEC1的活性窗口有大概含5個核苷酸,目標(biāo)堿基C在原型間隔序列上第4~8堿基的位置。常用的SpCas9的PAM NGG在第21~23堿基的位置,編輯窗口內(nèi)的全部堿基C都有可能被編輯[23,27],這樣就會導(dǎo)致活性窗口中非目標(biāo)的堿基C也會發(fā)生替換作用。而且因為大多數(shù)位點在靶點堿基下游缺少PAM序列,PAM NGG序列的要求限制了單堿基基因編輯系統(tǒng)可以編輯的基因組位點。因此,縮小編輯窗口或擴大PAM識別序列類型成為亟待解決的問題。

    鑒于上述問題,David LIU實驗室通過多種嘗試,發(fā)現(xiàn)對胞苷脫氨酶進行突變,可以縮小編輯窗口。他們針對rAPOBEC1的催化位點W90及結(jié)合位點R126和R132進行突變檢測,發(fā)現(xiàn)W90Y,W90F,R126A,R126E和R132E突變均可縮小活性窗口。將這3個突變位點進行組合突變,篩選出了可以進一步縮小編輯窗口,提高編輯精準(zhǔn)性的優(yōu)化編輯器:YE1-BE3(W90Y+R132E),YE2-BE3(W90Y+R126E),EE-BE3(R126E+R132E)和YEE-BE3(W90Y+R126E+R132E)。前3個編輯器的編輯窗口約2個堿基,編輯效率與BE3相似。YEE-BE3在平均編輯效率只降低了96.6%的情況下,將編輯窗口精確到了1個堿基C,大大提高了編輯的精準(zhǔn)性。在包含多個C堿基的BE3編輯窗口內(nèi),這些優(yōu)化的編輯器具有編輯位置偏好性,一般是C5>C6>C7≈C4[38]。

    目前,常用的SpCas9蛋白識別的PAM一般是NGG,SaCas9蛋白識別的PAM是NNGRRT,這在傳統(tǒng)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用中也受到限制。為了擴大CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的靶向范圍,多個實驗室對Cas9蛋白進行了突變篩選,得到了許多優(yōu)化突變體[39-40]。為了擴大單堿基基因編輯系統(tǒng)可編輯的基因組位點,David LIU實驗室將優(yōu)化的Cas9突變體代替BE3和SaBE3中相應(yīng)的Cas9蛋白,獲得了優(yōu)化的單堿基編輯器:VQRBE3,EQR-BE3,VRER-BE3 和SaKKH-BE3。他們識別的PAM分別是NGAN,NGAG,NGCG和NNNRRT,而且VQR-BE3和EQR-BE3的脫靶率更低[38]。

    當(dāng)然,上述對PAM識別的擴展對于龐大的基因組編輯來講是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。2018年2月,David Liu實驗室在Nature上發(fā)表了新的研究成果,極大地拓寬了基因編輯的應(yīng)用范圍[41-42]。該團隊利用噬菌體輔助持續(xù)進化(phage-assisted continuous evolu?tion,PACE)的定向進化技術(shù),基于SpCas9開發(fā)出了新型基因編輯工具酶——xCas9。其中的xCas9 3.7除了能夠識別NGG PAM之外,對于NG,NNG,GAA,GAT及CAA這些PAM序列也能夠識別。將xCas9 3.7替換BE3和ABE7.10中的SpCas9,構(gòu)建 xCas9(3.7)-BE3 和 xCas9(3.7)-ABE單堿基編輯器。研究發(fā)現(xiàn),在NGG PAM位點,xCas9(3.7)-BE3編輯效率為(37±10)%,而SpCas9-BE3的編輯效率為(28±5.2)%;在NGT,NGA和NGC PAM位點,xCas9(3.7)-BE3編輯效率分別為SpCas9-BE3的9.5,3.5和13倍;而在GAA 和GAT PAM位點,xCas9(3.7)-BE3編輯效率分別是SpCas9-BE3的50倍以上和100倍以上;xCas9(3.7)-ABE的編輯效率同樣高于SpCas9-ABE,在NGG PAM位點,xCas9(3.7)-ABE編輯效率為(69±3.7)%,而SpCas9-ABE的編輯效率為(48±2.1)%;在GAT PAM位點,xCas9(3.7)-ABE編輯效率為(16±1.5)%,而SpCas9-ABE未檢測到編輯(≤0.1%);在NGC和NGA PAM位點,xCas9(3.7)-ABE編輯效率分別為(21±2.5)%和(43±1.5)%,而SpCas9-ABE的編輯效率分別為(7.0±1.3)%和(22±1.2)%。xCas9 3.7脫靶率很低,xCas9 3.7的PAM序列識別靈活性、酶活性和保真性同時得到優(yōu)化的機制尚不明確。

    除了上述對單堿基基因編輯系統(tǒng)的優(yōu)化,國內(nèi)外的很多研究團隊在其他方面也進行了積極的探索,提高了單堿基編輯系統(tǒng)的精確性[43-45]。

    2 單堿基基因編輯技術(shù)在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

    單堿基基因編輯技術(shù)自首次報道至今,已經(jīng)在疾病治療、動物疾病模型制作和藥物篩選等方面得到了廣泛的應(yīng)用,取得了較好的編輯效果。

    人類遺傳疾病中,約2/3是由單堿基突變造成的。在人類單堿基突變相關(guān)的疾病中,由C∶G突變?yōu)門∶A導(dǎo)致的疾病占48%,由A∶T突變?yōu)镚∶C導(dǎo)致的占疾病14%[24]。單堿基基因編輯技術(shù)為這些疾病的治療提供了有力的支持。PCSK9是高膽固醇血癥的重要靶點,PCSK9敲除可顯著降低血液中低密度脂蛋白膽固醇水平[46]。Chadwick等[47]將可導(dǎo)致PCSK9基因無義突變的BE系統(tǒng)導(dǎo)入成年小鼠的肝中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),血液中PCSK9蛋白表達水平大幅下降(>50%),膽固醇水平降低約30%,而且未檢測到脫靶。HBB-28(A>G)突變是中國及東南亞β-地中海貧血病患者的主要致病因素。中山大學(xué)黃軍就課題組采集HBB-28(A>G)純合體患者的血液細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞,通過核移植技術(shù)構(gòu)建突變胚胎,將BE3和sgRNA注射到核移植胚胎中,胚胎的基因修正效率超過了23%,證實了單堿基基因編輯系統(tǒng)可以針對單堿基突變的人類胚胎基因組進行精確的修復(fù),為點突變遺傳性疾病的治療具有重要的臨床前研究意義[48]。

    韓國首爾大學(xué)Jin-Soo Kim研究團隊率先利用BE系統(tǒng)進行了動物疾病模型的制備,他們將BE3的mRNA或融合蛋白與靶向抗肌萎縮蛋白基因Dmd以及酪氨酸酶基因tyr的sgRNA,通過電轉(zhuǎn)染或顯微注射方式導(dǎo)入小鼠的受精卵[49]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在靶向Dmd基因的F0代小鼠(9只)中,約50%發(fā)生無義突變,其中1只是純合子突變小鼠,在靶向Tyr基因的F0代小鼠(7只)中,基因編輯效率達100%,其中3只是純合子突變小鼠。利用BE3在非洲爪蟾的早期胚胎中對tyr基因進行單堿基基因編輯,編輯效率為20.5%,且無脫靶突變,這表明單堿基基因編輯技術(shù)是建立非洲爪蟾人類點突變疾病模型的有力工具[50]。在兔的疾病模型中,用BE3和ABE7.10系統(tǒng)在囊胚和F0代分別可以實現(xiàn)53%~88%和44%~100%的靶向突變效率,通過有效誘導(dǎo)無義突變和錯義突變,單堿基基因編輯技術(shù)在兔子中可以準(zhǔn)確模擬人類此類疾病發(fā)病過程[51]。

    上海交通大學(xué)常興課題組研發(fā)了dCas9-AIDx單堿基編輯系統(tǒng),其靶向性AID介導(dǎo)的堿基突變發(fā)生(targeted AID-mediated mutagenesis,TAM)技術(shù)可以將細(xì)胞內(nèi)的特定DNA序列多樣化,從而進行高通量功能獲得性單堿基突變篩選。這一方法可以有效且迅速地模擬腫瘤細(xì)胞體內(nèi)耐藥機制的異質(zhì)性,從而進行腫瘤耐藥突變的篩選。該課題組用dCas9-AIDx在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中編輯BCR-ABL,有效鑒定了慢性髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞中對伊馬替尼(imatinib)抗性的已知突變和新突變[29]。斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)系和藥理學(xué)系的研究者報道的CRISPR-X也使用了dCas9和AID突變體,以及攜帶MS2修飾sgRNA,可以同時靶向多個基因組位點。研究者利用CRISPR-X突變了癌癥治療藥物硼波替單抗(替佐米,bortezomib)的靶點——PSMB5,結(jié)果從中鑒定了引發(fā)波替單抗耐藥性的已知和全新的突變[30]。由于耐藥金黃色葡萄球菌的出現(xiàn),迫切需要新的治療金黃色葡萄球菌感染的治療手段,研究者利用Cas9n(D10A)和APOBEC1融合形成單堿基編輯系統(tǒng)pnCasSA-BEC,能夠高效地使金黃色葡萄球菌發(fā)生點突變和基因失活,該系統(tǒng)的發(fā)展將極大地加速金黃色葡萄球菌藥物靶點的研發(fā)[52]。

    3 單堿基基因編輯技術(shù)存在的主要問題

    相對于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9編輯技術(shù),單堿基基因編輯技術(shù)對于基因組單堿基位點具有更高的編輯效率、更高的精確度和更低的脫靶率,由于不引入DSB,插入/缺失突變的發(fā)生率更低。因此,單堿基編輯技術(shù)成為生命科學(xué)領(lǐng)域全球研究的熱點。然而,目前所使用的單堿基編輯工具還存在著一些不足。

    3.1 堿基轉(zhuǎn)換的局限性

    人類單堿基突變相關(guān)的疾病中,還存在G∶C突變?yōu)镃∶G(占11%),T∶A突變?yōu)锳∶T(占7%),A∶T突變?yōu)镃∶G(占6%)和C∶G突變?yōu)锳∶T(占15%)的疾?。?4],但目前的DNA單堿基基因編輯技術(shù)無法進行修正。因此,還需要進一步開發(fā)針對各種單堿基突變類型的單堿基編輯工具。

    3.2 堿基編輯的安全性

    雖然有研究驗證了單堿基基因編輯技術(shù)在全基因組水平上的準(zhǔn)確性[53],但仍然存在安全風(fēng)險。主要表現(xiàn)在:①靶位點會產(chǎn)生C到非T或A到非G的轉(zhuǎn)換;②編輯窗口內(nèi)非目標(biāo)C或A堿基的編輯;③靶位點仍會產(chǎn)生極少量的插入/缺失突變;④脫靶效應(yīng)雖然低,但仍然存在;⑤胞苷脫氨酶和優(yōu)化的大腸桿菌TadA酶,都具有結(jié)合DNA進行脫氨基的作用,如果脫氨酶的表達量過高,可能會對基因組的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響。

    3.3 PAM識別序列的限制

    雖然xCas9極大拓寬了基因編輯的應(yīng)用范圍,但也只能夠直接靶向1/4人類基因組序列[41],而且David LIU實驗室僅在基因組的幾十個位點上進行了測試,現(xiàn)在還不能100%確定xCas9將比SpCas9更好,還需更多的實驗驗證。

    3.4 在體基因治療的可行性

    單堿基基因編輯技術(shù)是將Cas9和胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶以及UGI等形成融合蛋白來行使作用,用得較多的是SpCas9,這使其序列組成比較長,如果用常用的基因治療載體——腺相關(guān)病毒進行轉(zhuǎn)染,則腺相關(guān)病毒的包裝容量限制了該技術(shù)的應(yīng)用。SaCas9的編碼序列比SpCas9要小23%,這一大小差異使得SaCas9適于以病毒為載體的基因治療[54]。但是,SaCas9的PAM特異性又限制了編輯范圍,或許也可通過定向進化技術(shù),像改造SpCas9那樣來改造SaCas9的PAM特異性。如果不使用病毒載體,則需要積極探索其他途徑,比如基于金納米簇的納米遞送體系[55],以期開發(fā)出更加安全高效的方法。

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