應(yīng)用流式液相芯片技術(shù)分析廈門地區(qū)女性人乳頭瘤病毒感染現(xiàn)狀

晁鵬麗，黃松潔，方贊熙

隨著生物科學(xué)領(lǐng)域研究的不斷深入，生物芯片面世，然而由于生物芯片技術(shù)本身的局限性，并不能很好地運(yùn)用于臨床。美國(guó)Luminex公司研發(fā)了液態(tài)芯片技術(shù)——多功能多指標(biāo)并行分析系統(tǒng)（Flexible Multi-Analyte Profiling system，xMAP 技術(shù)）解決了這個(gè)問(wèn)題，xMAP技術(shù)1次檢測(cè)，最多可以檢測(cè)100種指標(biāo)，既能檢測(cè)蛋白質(zhì)，也能檢測(cè)基因。在本研究中，利用該技術(shù)對(duì)HPV的27個(gè)亞型可同時(shí)進(jìn)行分析。

人乳頭瘤病毒（HPV）是目前唯一確定的與腫瘤相關(guān)的病毒，除了眾所周知的宮頸癌，還與喉鱗癌，以及一些生殖器、肛門等癌癥相關(guān)。其中宮頸癌是女性好發(fā)腫瘤之一，居第二位。我國(guó)每年新發(fā)的病例約有十幾萬(wàn)，其中近兩萬(wàn)人死于該病，而HPV是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件。本研究通過(guò)對(duì)本地區(qū)517例體檢女性宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV基因的27個(gè)常見(jiàn)亞型的檢測(cè)，探討HPV隱性感染及亞型分布情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2014年10月至2015年6月在廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢的517例女性，均無(wú)明顯臨床癥狀。年齡范圍25～73歲，取材時(shí)要求避開(kāi)月經(jīng)期，48h內(nèi)無(wú)性生活、陰道未使用藥物沖洗液。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 先用無(wú)菌棉簽擦去宮頸口過(guò)多的分泌物，然后用配套的采樣刷子，按照婦科常規(guī)取樣程序，采集宮頸脫落細(xì)胞。采集手法需輕柔亦要保證采集到足夠量的細(xì)胞可供檢測(cè)。采集完畢后將刷子放入專用樣本管，輕輕搖晃管子，利用管內(nèi)的保存液將刷子上的細(xì)胞洗脫下來(lái)。蓋緊瓶蓋，做好標(biāo)記。并在“醋酸白”等實(shí)驗(yàn)前，采集宮頸脫落細(xì)胞。4℃保存，一周內(nèi)檢測(cè)。

1.2.2 儀器與試劑 主要儀器：Life Eco基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司），Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀（上海透景生命科技有限公司）。試劑：人乳頭瘤病毒基因分型試劑盒(上海透景生命科技有限公司)。共可檢測(cè)27種亞型，依據(jù)Cogliano V[1]和Schiffman M[2]的報(bào)道分為低危亞型10種：6、11、40、42、43、44、55、61、81、83；高危亞型 17 種：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82；以及內(nèi)對(duì)照 Globin。

1.2.3 HPV DNA 提取 充分混勻樣本，吸取 200μl到潔凈的 1.5ml離心管，14000r/min 離心 3min，吸棄上清，每管中加入200μl的提取緩沖液，振蕩均勻，放入100℃金屬浴中保溫15min，將離心管取出14000r/min離心5min，上清液備用。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 取PCR反應(yīng)管，在其中加入15μl配制好的反應(yīng)體系和5μl的已提取待測(cè)樣本，加樣結(jié)束后放置擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 雜交與熒光染色 在雜交板各 孔中加 入22μl微球雜交液，再在對(duì)應(yīng)孔中加入3μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交完成后，加入75μl的熒光素SAPE，反應(yīng) 15min。

1.2.6 上機(jī)檢測(cè) 將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的Luminex流式分析儀上讀取結(jié)果。結(jié)果判斷：透景HPV計(jì)算軟件可以自動(dòng)判斷結(jié)果。其判斷的標(biāo)準(zhǔn)如下：每孔均含陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照Globin，內(nèi)對(duì)照Globin的信號(hào)大于150，且大于等于2.5倍背景信號(hào)值，如否，可能是樣本中沒(méi)有采集到細(xì)胞或某種試劑失效，則需重新采樣重新實(shí)驗(yàn)。各亞型陰陽(yáng)性判斷亦遵從該標(biāo)準(zhǔn)，亞型信號(hào)＞150，且≥2.5倍背景信號(hào)，為陽(yáng)性；反之，為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，感染率的差異比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況 517例體檢女性中總的HPV感染率為 19.3%，按年齡分為 25～30 歲、31～35 歲、36～40 歲、41～45 歲、46～50 歲、51～55 歲、＞55 歲 7個(gè)組， 各組 HPV 感染率分別為 18.9%、25.0%、16.2%、24.0%、18.5%、18.6%、12.3%，χ2=5.446，P=0.488；各組低危感染率分別為 1.9%、13.2%、5.4%、4.2%、4.9%、7.0%、3.7%，P=0.108（精確概率法）；高危 感 染 率 分 別 為 17.0% 、19.7% 、10.8% 、20.8% 、16.0%、11.6%、8.8%，χ2=6.675，P=0.352。 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPV陽(yáng)性例數(shù)中總的人群混合感染例數(shù)占 27.0%， 各年齡組分別為 10.0%、63.0%、27.8%、8.7%、40.0%、0、12.3%，P=0.02 （精確概率法），差異明顯，其中以31～35年齡組最高、其次是46～50年齡組、再次是36～40年齡組。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 總?cè)巳杭案髂挲g段HPV感染率、低危感染率、高危感染率和混合感染率

2.2 不同年齡組亞型分布情況 31～50年齡段低危亞型感染呈多樣化，而25～30年齡段和＞50歲年齡段低危亞型感染較單一。高危亞型：25～30年齡組常見(jiàn)感染亞型是18型和52型；31～35年齡組16和52型最多，其次是18和59型；36～40年齡組51、52、53、56 和 59 型較其他型多見(jiàn)；41～45 年齡組 52 型較多見(jiàn)；46～50 年齡組 39、51、52、58 較其他型多見(jiàn)；51～55年齡組亞型分布較簡(jiǎn)單，僅有51、52和53型，其中以52型最多見(jiàn)；＞55年齡組HPV陽(yáng)性的7例檢出的高危亞型有16、39、52、56和 58。而 26、31、35、82 則未發(fā)現(xiàn)感染例數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

1995年，國(guó)際癌癥研究署確定了“HPV感染是女性宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)高度瘤變（CINⅡ/Ⅲ）發(fā)生的必要條件”，歷年來(lái)的多項(xiàng)研究也進(jìn)一步證實(shí)了此觀點(diǎn)[3，4]。但由于在感染的初期，多數(shù)因?yàn)榕R床癥狀不明顯或?yàn)檠装Y表現(xiàn)，而被忽視甚至誤診，導(dǎo)致延誤治療時(shí)機(jī)，而逐漸病情惡化最終惡變。本文針對(duì)2014年10月至2015年6月期間來(lái)本院體檢的健康女性(年齡跨度25～73歲)的HPV檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)這一人群中HPV的感染率高達(dá)19.3%，且與年齡無(wú)明顯相關(guān)性，與項(xiàng)璐璐和姜樹(shù)朋報(bào)道的數(shù)據(jù) 21.7%和 21.1%相近[5，6]。 女性HPV低危亞型感染通常引起一些婦科良性病變，而高危亞型感染才是導(dǎo)致惡性病變的高風(fēng)險(xiǎn)因素。本文對(duì)HPV低危感染率和高危感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)人群總的HPV低危感染率為5.8%，而HPV高危感染率為15.5%，HPV高危感染要高出低危很多，且各年齡組均是如此。從年齡特點(diǎn)來(lái)看，HPV低危感染31～35年齡組高于其他年齡組，高危感染各年齡組無(wú)明顯差異。陳占國(guó)[7]報(bào)道相較于HPV單一感染，混合感染危害性更大，HPV混合感染是宮頸上皮由低級(jí)別病變向高級(jí)別病變發(fā)展進(jìn)而演變?yōu)閷m頸癌的重要危險(xiǎn)因素之一[8]，本結(jié)果中人群總的混合感染率為27.0%，其中31～35年齡組高達(dá) 63.2%， 其次是 46～50 年齡組 40.0%，再次是36～40年齡組27.8%。綜合上述結(jié)果可知，各年齡段的女性人群均存在宮頸癌發(fā)生的高危因素，31～35年齡段因其較高的HPV混合感染率而大大提高了患病的風(fēng)險(xiǎn)性。

表2 不同年齡組亞型分布情況（感染率）

高危型HPV致惡性病變能力與亞型密切相關(guān)[9]。2005年2月，經(jīng)國(guó)際癌癥研究署研究討論，導(dǎo)致宮頸癌的13種高危HPV亞型被確定，而當(dāng)HPV檢測(cè)應(yīng)用于宮頸癌篩查時(shí)不同亞型的致惡變能力差異需作為關(guān)鍵因素考慮在內(nèi)。在中國(guó)宮頸癌常見(jiàn)的高危亞型有 8 種：16、18、58、52、31、33、59 和45型[10]。在本結(jié)果中，不同年齡組HPV亞型分布特點(diǎn)：31～50年齡段低危亞型感染呈多樣化，而25～30年齡段和＞50歲年齡段低危亞型感染較單一。HPV高危亞型25～30年齡組感染以18型和52型為主；31～35年齡組16和52型最多，其次是18和59 型；36～40 年齡組 51、52、53、56 和 59 型較其他型多見(jiàn)；41～45年齡組52型較多見(jiàn)；46～50年齡組39、51、52、58 較其他型多見(jiàn)；51～55 年齡組亞型分布較簡(jiǎn)單，僅有51、52和53型，其中以52型最多見(jiàn)；＞55年齡組HPV陽(yáng)性的7例檢出的高危亞型有 16、39、52、56 和 58。 從本結(jié)果分析得出：宮頸癌常見(jiàn)亞型中， 本地區(qū)25～30歲、31～35歲和＞55歲這三個(gè)年齡段的女性以感染HPV16型和HPV18型為主；36～40、41～45、46～50、51～55 這四個(gè)年齡段的女性以感染HPV52型和HPV58型為主?？傮w來(lái)說(shuō)，本地區(qū)常見(jiàn)亞型基本和我國(guó)其他地區(qū)相符[11-13]。而不同年齡段間亞型分布的差異，可能與以下兩點(diǎn)有關(guān)：⑴機(jī)體防御清除病毒的能力；⑵性生活的頻次以及性伴侶的專一性。其中的相關(guān)性有待進(jìn)一步地驗(yàn)證。

從本結(jié)果研究分析來(lái)看，HPV感染可發(fā)生在各個(gè)年齡段， 且在 31～35、36～40 和 46～50 歲這三個(gè)年齡段中混合感染的幾率大。而HPV亞型與致病力及宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，HPV16和18是感染比例最高且與宮頸癌密切相關(guān)的主要2種亞型[14，15]， 在本結(jié)果中 25～30、31～35 歲和＞55 歲這三個(gè)年齡段的女性HPV16型和HPV18型感染率較大。因此各年齡段的婦女都應(yīng)重視HPV篩查，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡可能開(kāi)展HPV亞型檢測(cè)，可指導(dǎo)醫(yī)生更早地預(yù)警宮頸癌。針對(duì)HPV感染人群應(yīng)結(jié)合宮頸脫落細(xì)胞檢查，定期監(jiān)測(cè)，積極治療，預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。