采用組合方法制備具有抗微生物活性和透氣性的PVA納米纖維

制備了采用蜂蜜和聚六亞甲基雙胍（PHBM）混合物（Reputex20）處理的電紡聚乙烯醇（PVA）納米纖維，并評價其在傷口敷料中的適用性。使用傅里葉變換紅外光譜來證實從蜂蜜和Reputex20的功能部分引入電紡PVA納米纖維。通過評估其抗微生物活性、透氣性和抗張性能來表征官能化PVA納米纖維。用蜂蜜和PHMB混合物處理的PVA納米纖維顯示出良好的抗微生物活性和足夠的透氣性，這是應(yīng)用于傷口敷料的紡織材料的非常需要的特性。由諸如PVA的生物相溶性聚合物制成并以組合方式功能化的納米纖維可用于許多不同的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括傷口愈合繃帶和細胞或組織培養(yǎng)支架。紙漿和造紙工業(yè)可以采用類似的組合處理方法并根據(jù)需要為各種應(yīng)用開發(fā)多功能紡織品。

靜電紡絲能夠生產(chǎn)具有納米級直徑的納米纖維的分層結(jié)構(gòu)，得到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。電紡絲納米纖維提供的另一個優(yōu)點是可以將其功能化，以賦予紡織品、生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)過濾、防御等附加屬性和用途。傷口敷料是電紡絲納米纖維在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要應(yīng)用之一。

一種理想的創(chuàng)傷敷料必須模仿細胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)和功能生物學(xué)。這促進了上皮細胞的形成和新組織的形成。在體內(nèi)，ECM通過向細胞提供物理支持并促進細胞附著、增殖、遷移和分化的條件，在傷口愈合過程中起關(guān)鍵作用。隨著纖維的小直徑和隨機取向，電紡絲納米纖維使得ECM的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性降低。納米纖維的高表面積有助于在傷口附近納入合適的藥物和液體的吸收，更重要的是，納米纖維的高孔隙率使得細胞與外部環(huán)境之間的流體和氣體交換成為可能，防止傷口干燥和脫水。此外，納米纖維中的小孔尺寸防止外源微生物的滲透。

開發(fā)用作潛在傷口敷料的電紡絲納米纖維可分為4類：（1）無源；（2）交互式；（3）高級；（4）生物活性。被動傷口敷料符合傷口敷料的物理性（水和氣體滲透性）和形態(tài)（孔隙度）要求。需要這些性質(zhì)以保持傷口周圍的足夠水分并保護傷口組織免受機械創(chuàng)傷。交互式傷口敷料具有增值能力，例如限制傷口部位的細菌增殖并照顧形態(tài)學(xué)和物理要求。先進的交互式傷口敷料是藥物涂層的交互式傷口敷料。生物活性傷口敷料是具有足夠機械性和物理化學(xué)性質(zhì)的多功能系統(tǒng)

以前我們實驗室的研究表明，用蜂蜜處理PVA納米粒子（在本研究中使用）增強了它們的水汽傳輸特性。然而，蜂蜜對處理的PVA納米粒子沒有賦予任何抗微生物活性。另一方面，PHMBs被證明是廣譜抗微生物劑，其具有低風(fēng)險和優(yōu)異的收縮期特性，使用PHMB的另一個優(yōu)點是微生物發(fā)展抗性的可能性，對于PHMB而言可以忽略不計。以前的研究表明，使用基于PHMB的微生物溶液（Reputex20）處理PVA納米纖維已經(jīng)賦予PVA納米纖維的抗微生物活性，但損害了它們的水汽傳輸特性。

本研究采用了一種組合方法，其涉及用蜂蜜和Reputex20混合物處理PVA納米粒子。研究該方法在一系列應(yīng)用中是否可以賦予電紡絲納米纖維的多種功能。本研究的目的是通過蜂蜜和PHMBs的混合物應(yīng)用于傷口治療，使其具有可吸入的可呼吸性，并將其與PVA納米生物的有益特性結(jié)合在一起。

1 實驗方法

1.1 材料

PVA（重均相對分子質(zhì)量為89 000～98 000，99%水解）和Mueller Hinton瓊脂；液體培養(yǎng)基、大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 29213，市售；Reputex20殺菌劑溶液來自美國某公司；100%純度，未過濾的蜂蜜，來自美國某公司。

1.2 靜電紡絲溶液的制備

在90∶10離子水中有12%的PVA溶液和用作靜電紡絲原液的Rputex20蜂蜜混合物以前述方式制備。PVA的濃度是由初步實驗決定。首先將2.4 mg PVA溶解在15 mL去離子水中，在溫度80℃下間歇攪拌3 h。制備2 mL Reputex20、2 mL蜂蜜和1 mL去離子水的混合物，最終在使PVA溶液達到室溫后，使用磁力攪拌器將2種溶液混合，將PVA溶液升至室溫以使Reputex20和蜂蜜的高溫效應(yīng)最小化（這可能會損害混合物的性能）。

1.3 電紡設(shè)置

將裝有20號針頭并裝有該涂料的注射器放在PHD2000注入/抽出泵上。我們保持了0.02 mL/min的聚合物質(zhì)量。使用ES 30P.5W電源單元（γ高壓研究）將注射器的針頭充滿25 kV的電壓來紡絲納米纖維。將鋁收集器放置在與注射器的尖端。

Reputex20和蜂蜜中的PVA溶液制備的納米纖維作為經(jīng)處理的PVA納米纖維。處理的PVA納米纖維在155℃的溫度下熱交聯(lián)30 min以提高其在水性條件下的穩(wěn)定性，并且被稱為處理/熱交聯(lián)的PVA納米纖維。

1.4 掃描電子顯微鏡對PVA納米纖維的描述

使用Hitachi S-4300SE/N掃描電子顯微鏡（SEM）來表征處理過的PVA納米纖維的形態(tài)。使用2 kV的加速電壓，在納米線上無涂層。通過從網(wǎng)的各個位置測量80根纖維的直徑來計算纖維平均直徑。

1.5 傅里葉變換紅外光譜測量

使用Bruker Vertex70分光光度計獲得所有樣品的衰減全內(nèi)反射模式傅里葉變換紅外（FTIR）光譜。分光光度計配備液氮冷汞-碲化鎘檢測器，光譜記錄在4 000～800 cm-1的范圍內(nèi)。以4 cm-1的分辨率測量的平均128個干涉圖，并用Blackman-Harris 3項函數(shù)進行蛻化以計算光譜。來自帕克Balston模型75-52吹掃氣體發(fā)生器的干燥空氣用于連續(xù)吹掃分光光度計臺和樣品室。所有的測量都是在溫度23℃下進行的

布菌侵犯血液系統(tǒng)時表現(xiàn)為白細胞減少、血小板降低和貧血。血小板減少癥是布菌感染血液系統(tǒng)最常見的并發(fā)癥。血小板減少癥的原因尚不清楚，可能與脾功能亢進、血管炎、骨髓抑制、自身免疫性溶血和血小板破壞有關(guān)。Demir等[44]對48例布病血液異?；颊吖撬杌顧z結(jié)果分析，吞噬細胞的吞噬作用、骨髓中肉芽腫形成和脾功能亢進可能是導(dǎo)致布菌血液病的主要原因。

1.6 抗微生物活性試驗

針對革蘭陽性（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性（E.coli）細菌測試了處理和處理/熱交聯(lián)的PVA納米纖維的抗微生物活性。簡單來說，將一個測試細菌的細菌條紋劃到新鮮的Mueller Hinton瓊脂平板上。將板培養(yǎng)24 h以具有用于評估處理的PVA納米纖維的抗微生物活性的活性接種物。一種0.5麥克法蘭德（McFarland）當(dāng)量的濁度標(biāo)準(zhǔn)測試菌被紋在新鮮的瓊脂板上并與納米纖維（切成6 mm直徑的圓盤）培養(yǎng)24 h。抑制劑的存在表明抗菌素活性。納米纖維在紫外線（每側(cè)15 min）下滅菌，以避免任何放射性污染問題。經(jīng)處理的PVA納米粒子命名為HR（HR1，HR2和HR3），將處理/熱交聯(lián)的PVA納米粒子命名為CL（CL1，CL2和CL3）。

1.7 處理過的PVA納米纖維的濕蒸氣傳輸率評估

英國標(biāo)準(zhǔn)蒸發(fā)皿法BS 7209：1990《水氣滲透服裝織物規(guī)范》用于評價經(jīng)處理的PVA納米纖維的水蒸氣滲透性，根據(jù)蒸氣傳輸速率（MVTR）[g/（m2·d-1）]測量來表征納米纖維的透氣性，并使用方程式（1）來計算：式中：M為在一個給定時期t（g）的集合中的衰減量；t為在連續(xù)的質(zhì)量之間的時間（h）；A為暴露試驗樣品的面積（0.005 413 m2）。

1.8 對PVA納米纖維的抗張性能的測定

用英斯特朗電子拉力機5569拉伸試驗機測量處理的PVA納米纖維的抗張性能。使用2.5 mm/min的十字頭速度的2.5牛頓載體細胞進行測量。確定最大負載（N），最大負載延伸（mm）和最大模量（MPa）的最大值。使用2 cm的標(biāo)距。將樣品切成尺寸為1 cm×3 cm的片狀，進行試驗。采用ASTM D638-10《塑料拉伸性能的標(biāo)準(zhǔn)試驗方法》（修訂版）進行測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 處理過的PVA納米纖維的形態(tài)

圖1顯示了經(jīng)處理的納米纖維的SEM圖像。

經(jīng)處理的PVA納米纖維的平均纖維直徑為548 nm（±162 nm）。大多數(shù)納米纖維的直徑為400～700 nm。納米纖維的形態(tài)似乎受到蜂蜜存在的影響，導(dǎo)致形成珠狀結(jié)構(gòu)。這可能是由于蜂蜜引起的靜電紡膠粘劑黏度的增加。蜂蜜是一種高黏度的溶液，它確實增加了靜電紡絲原液的黏度，在處理/熱交聯(lián)的PVA納米纖維上不能進行進一步的研究。

圖1 經(jīng)處理的PVA納米纖維的掃描電子顯微鏡圖像和纖維直徑分布直方圖

2.2 處理的PVA納米纖維的FTIR光譜

圖2和圖3顯示了比較天然的（native）和處理的PVA納米纖維的紅外光譜測量結(jié)果。

經(jīng)處理的PVA納米纖維的光譜（圖2和圖3）包含蜂蜜和Reputex20溶液和天然PVA納米纖維共有的特征。在天然PVA納米纖維中不存在1 012 cm-1和2 210 cm-1處出現(xiàn)的峰。在1 025 cm-1附近的峰值明顯。

蜂蜜和出現(xiàn)在2 l76 cm-1的峰值在RePutex20光譜中也很常見，光譜中顯示了在靜電紡絲過程中成為合成PVA基質(zhì)的蜂蜜和RePutex20溶液的組分（圖2和圖3）。與蜂蜜相關(guān)的特征是非常明顯的。相比之下，Reputex20的特征更難以辨別，蜂蜜可能比RePutex20更有效地競爭PVA基質(zhì)內(nèi)的結(jié)合位點。

在較低能譜區(qū)域，天然PVA非網(wǎng)絡(luò)具有與C—O振動相關(guān)的1 094 cm-1附近的強帶，天然PVA納米纖維（圖2的“a”）光譜中的1 050～950 cm-1區(qū)域是相對無特征的。蜂蜜的光譜在1 025 cm-1附近具有強峰，其具有延伸到較高能量CO特征的較弱特征，蜂蜜共振的彎曲振動。在處理的PVA納米纖維中鑒定了1 012 cm-1附近的峰，這可歸因于蜂蜜在PVA基質(zhì)內(nèi)的摻入。

圖2 在800～1 700 cm-1的低能量區(qū)域（紫外線）中的（a）（天然）PVA納米纖維，（b）PVA納米纖維，（c）純蜂蜜中的樣品的全內(nèi)反射光譜，（d）純Reputex 20解決方案

圖3 在1 000～3 500 cm-1的高能區(qū)域，樣品的全內(nèi)反射光譜的衰減[（a）（天然）PVA納米纖維，（b）PVA納米纖維，（c）純蜂蜜，（d）純Reputex20解決方案，（b）擴展了橫坐標(biāo)為5的波數(shù)區(qū)域的Y軸刻度]

在較高的能譜區(qū)域中，在處理的PVA納米纖維的四面體中出現(xiàn)了2 210 cm-1附近的弱帶（圖2的“b”）。在2 l76 cm-1的Reputex20光譜中可以看出類似的譜帶，其可以被吸引到CN拉伸腈基。該帶為Reputex 20中的功能部分整合到PVA基質(zhì)中提供了附加價值。

沒有從處理/熱交聯(lián)的PVA納米纖維上獲得光譜。處理后的PVA納米線變得非常脆弱，用于在熱交聯(lián)后用衰減的全反射晶體進行檢查。

2.3 處理過的PVA納米纖維的抗微生物活性

抗微生物活性是傷口敷料重要的屬性。前人嘗試用蜜蜂對PVA納米纖維進行功能化。

蜂蜜功能化的PVA納米纖維對測試的微生物沒有抑制作用，盡管純蜂蜜表現(xiàn)出顯著的抗微生物活性，其原因可能是蜂蜜的濃度低，活性成分從納米纖維有效擴散了。蜂蜜是一種非常黏稠的溶液，當(dāng)用于靜電噴涂時需要稀釋。因此，在本研究中添加了一種市售的抗微生物Reputex20，其中含有PHBM與PVA溶液和蜂蜜的混合物。這是為了考察其組合方法是否有益處。

圖4顯示了用經(jīng)處理的PVA納米纖維對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抗微生物的測定結(jié)果。

圖4 處理/熱交聯(lián)（黑色）PVA天竺葵的抗微生物活性[（a）納米纖維對大腸桿菌的活性；（b）金黃色葡萄球菌納米纖維的活性]

經(jīng)處理的PVA納米纖維[圖4（a）和圖4（b）]已經(jīng)證實了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗微生物活性。在處理過的PVA納米粒子[圖4（a）和4（b）中的HR1、HR2和HR3]附近觀察到抑制區(qū)，表明處理與PHMBs和蜂蜜的混合物具有功能化的PVA納米纖維。

處理的納米纖維的FTIR光譜的結(jié)果也支持這一觀察，其中觀察到從Reputex20引入活性部分（PHMB）到PVA基質(zhì)中。S.aure的抑制區(qū)的直徑為13 mm。

2.4 官能化PVA納米棒的透氣性

傷口敷料經(jīng)常被忽視的屬性是透氣性，它控制著傷口中水分和其他滲出物的損失。研究表明，傷口敷料在2 000～2 500 g/（m2·d-1）范圍內(nèi)的呼吸能力可防止傷口過度脫水和傷口滲出物積聚。這就是為什么我們要求以實驗來定量官能化PVA納米纖維的透氣性。

在我們的研究中，官能化PVA納米纖維的透氣性是為185 685 g/（m2·d-1）（n=5，se=3 632）。因此，可以推斷官能化PVA納米纖維已經(jīng)顯示適合用于傷口敷料應(yīng)用的透氣性值[在2 000～2 500 g/（m2·d-1）的范圍內(nèi)]。這樣的現(xiàn)象可以解釋為以下幾點原因。首先，F(xiàn)TIR光譜已經(jīng)證實蜂蜜成分與功能化PVA納米纖維的結(jié)合。這涉及將碳水化合物功能組1納入PVA基質(zhì)。這解釋了官能化PVA納米纖維顯示出優(yōu)異的濕氣傳播特性，因為基材的透氣性受到表面官能團的存在的很大影響。在我們的研究中，F(xiàn)TIR光譜表明向PVA基質(zhì)中添加碳水化合物官能團。天然PVA納米纖維譜（圖2的“a”）譜帶中的3 329 cm-1波段來自聚合物中醇基的O—H伸縮振動。在功能化PVA納米纖維的光譜中，帶寬顯著轉(zhuǎn)移到能量（3 240 cm-1）（圖2的“b”）。這種轉(zhuǎn)變反映了O—H基團氫鍵的作用。

2.5 官能化PVA納米纖維的抗張性能

傷口敷料必須具有一定的機械性能，例如抗張強度、可持續(xù)性、柔韌性、彎曲性和彈性。在這些物理處理中，抗張性能至關(guān)重要，因此我們強調(diào)評估官能化PVA納米纖維的韌性。

表1顯示了韌性的測量結(jié)果。

表1 官能化PVA納米纖維的抗張性能（n=5）

FTIR分析結(jié)果表明，官能化PVA纖維素譜圖中1 145 cm-1處有一個尖峰（圖2的“b”）。該峰的強度和銳度是增加PVA結(jié)晶度的特征，這在蜂蜜和Reputex20中也是明顯的。在PVA聚合物中的Reputex20和O—H基團中胺基和亞胺基之間的氫鍵驅(qū)動的PVA基體中的組織增加可能導(dǎo)致官能化PVA納米纖維中的1 145 cm-1峰的增長，或由于碳水化合物和PVA聚合物鏈段之間的相互作用而導(dǎo)致的PVA基質(zhì)中排序的結(jié)果。因此，與天然PVA納米纖維相比，功能化過程可能導(dǎo)致官能化PVA納米纖維的抗張性能增加。

3 結(jié)論

采用組合方法制備生物活性和透氣電紡PVA納米纖維，通過用蜂蜜和Reputex20的混合物官能化的PVA納米微粒。FTIR分析證實了在官能化的PVA納米纖維中存在來自蜂蜜和Reputex20的功能部分。官能化的PVA納米纖維顯示出良好的水汽傳輸特性，并表現(xiàn)出優(yōu)異的抗微生物活性。官能化過程也導(dǎo)致PVA納米纖維的抗張性能的提高。本研究強調(diào)了使用天然和后加工物質(zhì)組合的電紡絲納米粒子功能化的重要性，以提高其適用性。