VITEKⅡ全自動微生物鑒定系統(tǒng)在兩種微生物鑒定中的運用

衛(wèi)舒帆 劉靜萍

（1 昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650032；2 云南昊邦制藥有限公司，云南 昆明 650000）

近年來，微生物的檢測鑒定技術(shù)已逐步由手工檢測走向儀器化和電腦化，并力求簡便、快速、準(zhǔn)確。由法國梅里埃公司出品的全自動微生物鑒定系統(tǒng)是目前世界上最先進、自動化程度最高的細(xì)菌鑒定儀器之一，已被許多國家定為細(xì)菌最終鑒定設(shè)備，并獲美國藥品食品管理局（FDA）認(rèn)可。該系統(tǒng)有高度的特異性、敏感性和重復(fù)性，還具有操作簡便、檢測速度快的特點，絕大多數(shù)細(xì)菌的鑒定在2～18 h內(nèi)可得出結(jié)果。

筆者在對藥品大腸埃希菌和大腸菌群檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，部分檢測結(jié)果呈陰性的樣品，有時曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板上有粉紅色菌落生長，菌落周圍呈現(xiàn)浸潤現(xiàn)象，與《中國藥典》2010年版描述的大腸埃希菌的菌落形態(tài)相似?！吨袊幍洹?010年版對藥品中污染菌的檢測鑒定主要依靠生化實驗、血清學(xué)反應(yīng)等，不能準(zhǔn)確地檢測出該菌株的種類，而且生化實驗對于大量菌株的分類鑒定繁瑣費時、準(zhǔn)確性差；血清學(xué)檢測成本高昂，且易產(chǎn)生交叉反應(yīng)[1-6]。因此，尋找一種快速、準(zhǔn)確且成本低廉的方法鑒定藥品中污染菌株是很有必要的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品：小兒復(fù)方雞內(nèi)金散、六味地黃膠囊。

1.1.2 陽性對照菌液：大腸埃希菌（Escherichia coli）（CMCC（B）44102）。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑。pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（生產(chǎn)廠家：北京三藥科技開發(fā)有限公司，批號：1212272），膽鹽乳糖培養(yǎng)基（生產(chǎn)廠家：北京三藥科技開發(fā)有限公司，批號：1301052），4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（MUG，生產(chǎn)廠家：北京三藥科技開發(fā)有限公司，批號：121023），曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（生產(chǎn)廠家：北京三藥科技開發(fā)有限公司，批號：121123），乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（生產(chǎn)廠家：北京三藥科技開發(fā)有限公司，批號：121112），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（生產(chǎn)廠家：北京三藥科技開發(fā)有限公司，批號：1303262），95%乙醇及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡（生產(chǎn)廠家：美國BioMerieux?Inc，批號：241267940）。

1.1.4 主要儀器：VITEKⅡ全自動微生物鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃；DM500光學(xué)顯微鏡，德國Leica；BHC-1300ⅡA2生物安全柜，蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司；L600臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；YXQ-LS-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；BSP-150生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅菌：實驗所需培養(yǎng)皿、刻度吸管、量筒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中180 ℃滅菌2 h后備用。以上幾種培養(yǎng)基按照要求配制，置于立式壓力蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min，冷卻后備用。

1.2.2 供試液的制備：樣品均為水溶性固體制劑。分別取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀混勻，作為1∶10濃度供試液。取1∶10濃度供試液1 mL，加入裝有9 mLpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑的試管中，混勻，即得1∶100供試液。以此類推，制得1∶1000供試液。

1.2.3 增菌培養(yǎng)：取體積100 mL/瓶的膽鹽乳糖培養(yǎng)基各1瓶，各加入10 mL供試液（相當(dāng)于供試品1 g），搖勻，置30～35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。

1.2.4 陽性對照試驗：取體積100 mL/瓶的膽鹽乳糖培養(yǎng)基各1瓶，各加入10 mL供試液（相當(dāng)于供試品1 g），同時各加入1 mL大腸埃希菌菌液，搖勻，置30～35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，作為陽性對照。

1.2.5 陰性對照試驗：取體積100 mL/瓶的膽鹽乳糖培養(yǎng)基各1瓶，各加入10 mLpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，搖勻，置30～35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，作為陰性對照。

1.2.6 大腸菌群檢查：取乳糖膽鹽發(fā)酵管各3支，分別加入1∶10稀釋的供試液1 mL（含供試品0.1g）、1∶100稀釋的供試液1 mL（含供試品0.01g）、1∶1000稀釋的供試液1 mL（含供試品0.001 g）。另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵管，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑1 mL作為陰性對照。置30～35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。

1.2.7 觀察：兩個樣品的膽鹽乳糖增菌液中均有產(chǎn)氣發(fā)酵現(xiàn)象，小兒復(fù)方雞內(nèi)金散的增菌液表面有一層白色菌膜。小兒復(fù)方雞內(nèi)金散的乳糖膽鹽發(fā)酵管有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣。六味地黃膠囊的1∶10濃度的乳糖膽鹽發(fā)酵管有菌生長且產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

1.2.8 接種：分別取兩個樣品的膽鹽乳糖增菌液、陽性對照液、陰性對照液各0.2 mL，接種至含5 mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，搖勻。同時用滅菌接種環(huán)各挑取一環(huán)兩個樣品的膽鹽乳糖增菌液及六味地黃膠囊的1∶10濃度的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)液、陽性對照液、陰性對照液，分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上。將MUG試管和曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板置于30～35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.9 4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸（MUG）試驗和靛基質(zhì)試驗：根據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢ C微生物限度檢查法中，兩份樣品均未檢出大腸埃希菌。

1.2.10 觀察曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板：曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板于30～35 ℃培養(yǎng)24 h后，取出觀察?？梢姡盒簭?fù)方雞內(nèi)金散的曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板上有菌落生長。菌落呈粉紅色，不透明，無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，表面光滑、濕潤，但是無金屬光澤。六味地黃膠囊的曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板上有菌落生長。菌落呈粉紅色，呈半透明狀，無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，表面光滑、濕潤，無金屬光澤。陽性對照的曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板上有菌落生長。菌落呈紫黑色，菌落中心呈深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，有金屬光澤。

1.2.11 分離培養(yǎng)：用滅菌接種環(huán)分別挑取曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板上的典型菌落，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，置30～35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。

1.2.12 革蘭染色、鏡檢。小兒復(fù)方雞內(nèi)金散中的菌體特征為：革蘭染色呈陰性，直桿狀，周生鞭毛，常成對存在。六味地黃膠囊中的菌體特征為革蘭陰性短桿菌，有鞭毛，常成對存在。

1.2.13 用VITEK Ⅱ全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定：根據(jù)革蘭染色、鏡檢的結(jié)果，從兩個樣品中檢出的菌落均為革蘭陰性桿菌，故選擇革蘭陰性桿菌鑒定卡。

2 結(jié)果與分析

2.1 根據(jù)鑒定報告，小兒復(fù)方雞內(nèi)金散中的污染菌的拉丁名為Pantoea spp，查VITEK 2 GN 鑒定細(xì)菌目錄，中文名為泛菌屬；六味地黃膠囊中的污染菌的拉丁名為Escherichia vulneris，查VITEK 2 GN 鑒定細(xì)菌目錄，中文名為傷口埃希菌。

2.2 泛菌屬為兼性厭氧，具有代謝和發(fā)酵類型的化能異養(yǎng)菌。分離自植物表面、種子、土壤和水，也可從動物和人的傷口、血和尿中分離到。

傷口埃希菌屬于埃希菌屬的一種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有大腸埃希菌（E.coli）、蟑螂埃希菌（E.blattae）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫爾曼埃希菌（E.hermanii）、傷口埃希菌（E.vulneris）和低活性埃希菌（E.coli inactive）。中國藥典以大腸埃希菌和大腸菌群作為藥品糞便污染的指示菌。

以上兩類菌都屬于條件致病菌，在一定條件下，如機體抵抗力下降、寄居部位發(fā)生改變或腸道菌群失調(diào)時能引起機會感染或二重感染。

3 結(jié) 論

經(jīng)鑒定，兩種污染菌分別為泛菌屬和傷口埃希菌，均為條件致病菌。這兩種細(xì)菌在藥品檢驗過程中出現(xiàn)頻率較高，應(yīng)當(dāng)在藥品生產(chǎn)儲存過程中加以重視。VITEKⅡ全自動微生物鑒定系統(tǒng)能夠在較短的時間內(nèi)，準(zhǔn)確鑒定出污染菌的種類，成本低廉、方便快速，具有很高的實用性，對藥品微生物限度檢測具有重要的意義。

參考文獻

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