植物抗逆和開花相關(guān)miRNA研究進展及在絲瓜上的應(yīng)用

劉 哲， 許園園， 婁麗娜， 蘇小俊

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014)

miRNA是一種非編碼小RNA，總長度為20～22個核苷酸，存在于生物體內(nèi)[1-2]。1993年第1個miRNA(lin-4miRNA)基因在線蟲(Caenorhabditiselegans)中被發(fā)現(xiàn)，直到2002年第1個植物miRNA被發(fā)現(xiàn)[3-4]，對植物miRNA的研究才逐漸得到世界各國科研人員的關(guān)注。雖然對植物miRNA的研究從21世紀初才開始，與動物miRNA的研究相比還存在一定差距，但隨著miRNA研究方法的不斷更新以及專業(yè)儀器設(shè)備的更新?lián)Q代，植物miRNA被發(fā)現(xiàn)的數(shù)量也不斷增加，種類也不斷豐富。目前，已經(jīng)在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(OrzasativaL.)、絲瓜屬(Luffaspp.)、玉米(ZeamaysL.)、普通小麥(TriticumaestivumL.)、蕨類(Pteridophyta)等植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了不同數(shù)量和類型的miRNA[5-12]。

1 植物miRNA的合成

miRNA的生物進化過程在植物中是相對保守的，并且在植物和動物中有較大的同源性，使得其在結(jié)構(gòu)和功能上有較大的相似性[13]。MIR基因編碼植物miRNA，且在擬南芥中，大部分MIR基因位于基因間隔區(qū)[14]。miRNA的生物合成可分為以下幾步：(1)MIR基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄形成miRNA初級轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA[15]。pri-miRNA結(jié)構(gòu)中含有1個特殊結(jié)構(gòu)，即不完全的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠被核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)家族蛋白DICER-LIKE 1(DCL1)特異性識別并加工為miRNA前體[13，16]。(2)在DCL1等蛋白的作用下，pre-miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)被去掉，進而形成具有miRNA/miRNA*復(fù)合體結(jié)構(gòu)的雙鏈miRNA[14]。(3)在解旋酶作用下，該雙鏈miRNA在細胞質(zhì)中被分解為2條單鏈，而miRNA在ARGONAUTE 1(AGO1)復(fù)合體的作用下得以保留，進一步形成能作用于靶基因miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，簡稱RISC)[17]。然后，miRNA被降解，但是有研究表明，有些miRNA并不會被降解[18]。

2 植物miRNA功能的研究進展

2.1 逆境相關(guān)植物miRNA的研究進展

作物產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的提升可受到逆境脅迫的影響，國內(nèi)外科研人員正試圖揭示這一復(fù)雜的植物生長發(fā)育機制，關(guān)于其生物學(xué)機制的研究也越來越得到重視。近年來眾多研究表明，miRNA在植物脅迫響應(yīng)和抗逆性提高等方面具有十分重要的作用[5，19]。研究發(fā)現(xiàn)，在逆境脅迫因子誘導(dǎo)下，植物體內(nèi)會形成miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，這些復(fù)合物能與靶mRNA通過互補配對結(jié)合，進而調(diào)節(jié)其相應(yīng)靶基因mRNA的表達，從而有效調(diào)控下游與抵抗脅迫相關(guān)基因的表達，引起與相應(yīng)抗逆性相關(guān)代謝產(chǎn)物的增多或減少，實現(xiàn)對逆境的適應(yīng)。在調(diào)控靶基因時，1個miRNA可以調(diào)控多個靶基因，如在擬南芥中基因pho2和UBC24均可受miRNA399調(diào)控[20]；同時1個靶基因可受多個miRNA調(diào)控，如馮浩研究發(fā)現(xiàn)，興資9104的條銹病抗/感性狀是多條miRNA共同調(diào)控的結(jié)果[21]。

植物組織中的一些miRNA受幾種不同非生物脅迫的誘導(dǎo)。miR169家族包含17個miRNA，它們具有9種不同的序列結(jié)構(gòu)，干旱脅迫時，擬南芥通過抑制miR169a與miR169c的表達來提高抗旱性，但在水稻中，miR169g主要在根部和莖部表達，以提高水稻的抗旱性[22]。Kantar等利用 RT-PCR的方法研究發(fā)現(xiàn)，大麥葉片中Hvu-miR156a、Hvu-miR166、Hvu-miR171、Hvu-miR408的表達量在受到脫水處理后明顯增加[23]；另外，利用miRNA芯片技術(shù)對小麥研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同時間的干旱處理后，根和葉中都有miRNA表達且表達量遠高于對照[24]。在缺水處理時，蒺藜狀苜蓿(Medicagotruncatula)芽和根中的miR398a/b和miR408表達量明顯增加，而COX5b的表達受到抑制，說明編碼銅蛋白的COX5b可響應(yīng)缺水脅迫[25]。在低溫誘導(dǎo)下，毛果楊miR168、miR477以及擬南芥miR169、miR171、miR172、miR408等表達量明顯增加，但毛果楊miR156、miR475、miR476的基因表達量降低[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中miR417的表達受鹽害脅迫調(diào)節(jié)，其過量表達可提高擬南芥的抗鹽性[27-28]。同一種miRNA在不同的生理環(huán)境下發(fā)揮的作用不同，如利用基因沉默技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，miR395通過靶定腺苷5′-磷酰硫酸(adenosine 5′-phosphoryl sulphuric acid，簡稱APS)和AST68參與調(diào)節(jié)硫酸鹽在植物體內(nèi)的積累和配置，而在高鹽和干旱脅迫下的煙草(Nicotianatabacum)中，miR395的表達量明顯提高[29]。

一些植物miRNA的表達可受重金屬脅迫的影響。Ding等利用生物芯片對鎘脅迫下水稻miRNA的表達進行分析發(fā)現(xiàn)，水稻中存在19個與鎘應(yīng)答相關(guān)的miRNA，其中miR528的表達量在鎘脅迫下增加，miR162、miR168、miR396等的表達量下降[30]。在低硫的誘導(dǎo)下，擬南芥miR395的表達明顯受到抑制[31]。植物中響應(yīng)銅(Cu)脅迫的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子是miR398，在土壤高濃度Cu的脅迫下，miR398誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)基因過量表達，合成更多的Cu/鋅(Zn)-SOD酶，從而使銅離子流向SOD，降低銅離子的含量和毒害，使得植物體內(nèi)的銅離子達到平衡。

2.2 miRNA參與植物開花調(diào)控的研究進展

miR156和miR172家族在調(diào)控植物開花過程中具有重要作用，同時，它們也是年齡途徑的重要組成成員[32-33]。其中miR172在葉片和花蕾中的豐度隨著植物年齡的增大不斷增加，而miR156在胚胎和早期植物幼苗中的表達量較高，且隨著植物年齡的增大而降低[34]。

在擬南芥中，與開花相關(guān)的miR156家族包括miR156a～miR156j共10個成員[32]，它們能靶向作用于17個SPL(squamosa promoter-binding potein-like)轉(zhuǎn)錄因子中的11個，并通過轉(zhuǎn)錄切割的方式下調(diào)這些SPL基因的表達。過表達miR156的植株表現(xiàn)出開花延遲和幼年階段延長等現(xiàn)象[33]。同時，在其他作物如水稻、番茄、玉米中過表達miR156也表現(xiàn)為開花延遲，表明miR156在控制開花的作用上是相對保守的[35-37]。

miR172家族包括miR172a～miR172e共5個成員，它們主要在miR156下游抑制開花[38]。通過核染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)驗證發(fā)現(xiàn)，miR156靶向基因為SPL9和SPL10，是miR172b的直接轉(zhuǎn)錄激活子，同時SPL9過表達轉(zhuǎn)基因株系中miR172的表達水平明顯升高[39]。在擬南芥中，miR172有6個靶基因，分別為AP2、TOE1、TOE2、TOE3、SMZ、SNZ[32]，這些基因是典型的開花抑制子，并且被miR172在轉(zhuǎn)錄水平抑制[40-41]。此外miR172的過表達也會導(dǎo)致FT、LFY、AP1等上調(diào)表達，同時，SMZ和TOE1也能調(diào)控FT基因表達[38]。

miR159靶向作用于MYB轉(zhuǎn)錄因子，而miR319靶向作用于TCP轉(zhuǎn)錄因子，它們在功能上有一定的冗余[42]。在擬南芥中，MYB33、MYB65、MYB101主要受miR159家族miR159a～miR159c 3個成員的調(diào)控[43]。有研究表明，miR159能參與調(diào)控植物開花中的赤霉素途徑，能夠促進擬南芥在短日照下開花[32]。TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、TCP24 等5個靶基因主要受miR319家族中miR319a～miR319c等3個成員的調(diào)控[44]。過表達miR319的擬南芥植株在長日照條件下呈現(xiàn)出晚花現(xiàn)象[45]，此外，失去TCP4基因功能的突變體植株也呈現(xiàn)出晚花現(xiàn)象[46]，進一步證明miR319在植物開花的控制過程中起到了重要作用。近年來，大量miRNA被發(fā)現(xiàn)與植物開花的時間調(diào)控有關(guān)，如miR390家族和miR399家族[42，47]。

3 絲瓜miRNA的研究

關(guān)于絲瓜及絲瓜所屬的葫蘆科miRNA的研究起步較晚。凌鍵利用重測序的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，簡稱SNP)數(shù)據(jù)分析了黃瓜miRNA位點的遺傳多樣性[48]。李超漢發(fā)現(xiàn)，NAM基因家族是miR164的靶標(biāo)基因，可調(diào)控植物的生長發(fā)育，通過利用高通量測序與生物信息學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與黃瓜嫁接苗對干旱、高鹽、缺氮、缺磷脅迫的應(yīng)答[49]。梁超瓊等研究發(fā)現(xiàn)，植物抗病過程和生長過程中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子主要受miR159和miR858調(diào)控[50]。郭清利對黃瓜葉片小RNA進行測序分析，在黃瓜葉片中共預(yù)測到82個miRNA，其中保守、非保守miRNA分別為42、40個，其中48個為首次發(fā)現(xiàn)的miRNA[51]。劉娜等通過Solexa測序分析發(fā)現(xiàn)，嫁接能夠影響植物的生長發(fā)育，并能提高植物對脅迫的抗性[52]。Chen等利用下一代測序技術(shù)對絲瓜品種YLB05(耐褐變)和XTR05(易褐變)的基因表達譜進行分析，獲得9.1 GB有效數(shù)據(jù)，提供了全面的轉(zhuǎn)錄組序列資源[9]。這些研究成果促進了絲瓜miRNA的研究，也為絲瓜耐褐變遺傳育種的深入研究提供了新的思路，相信隨著研究人員的不斷努力和生物信息學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展，絲瓜miRNA的研究會更為全面和深入。