蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）流行病學(xué)與檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

許 杰，鄧 威，李 軍，薛淑霞，馬文婷，霍文慧

（天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300221）

蝦肝腸胞蟲(chóng)（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）2009年首次在泰國(guó)生長(zhǎng)緩慢的養(yǎng)殖斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）中被分離而命名[1]，是一種高傳染性細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲(chóng)，近年來(lái)在泰國(guó)、印度、越南、馬來(lái)西亞、印度尼西亞和中國(guó)等主要對(duì)蝦養(yǎng)殖國(guó)家中流行，主要感染凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）和斑節(jié)對(duì)蝦等養(yǎng)殖蝦類，可導(dǎo)致對(duì)蝦生長(zhǎng)極其緩慢或停滯，是影響全球?qū)ξr養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要疾病之一[2]。

自2013年以來(lái)，我國(guó)沿海對(duì)蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)先后發(fā)現(xiàn)有EHP流行，且檢出率有增加趨勢(shì)。2015年遼寧省營(yíng)口市、盤錦市的對(duì)蝦EHP檢出率達(dá)34.6%[3]；粵西地區(qū)87份凡納濱養(yǎng)殖對(duì)蝦樣品的EHP檢出率為41.38%[4]；2015年浙江省舟山市大棚養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦普遍出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、養(yǎng)殖成功率低等現(xiàn)象，采集的270份病蝦樣本中，EHP檢出率高達(dá)85.19%[5]。本文就該病的流行病學(xué)及檢測(cè)技術(shù)等做一概述，以期為對(duì)蝦養(yǎng)殖病害防控提供技術(shù)參考。

1 分類地位及特性

微孢子蟲(chóng)種類繁多，廣泛寄生于節(jié)肢動(dòng)物和魚(yú)類體內(nèi)。由孢子形成的單細(xì)胞寄生蟲(chóng)，其孢子呈梨形、橢圓形、茄形等，孢子長(zhǎng)2～10 μm。微孢子蟲(chóng)主要寄生于對(duì)蝦的肌肉和肝胰腺內(nèi)，有時(shí)也寄生在心臟、胃、腸、鰓等處，感染嚴(yán)重時(shí)可引起病蝦死亡，甚至大批死亡[6]。早期發(fā)現(xiàn)寄生于對(duì)蝦體內(nèi)的微孢子蟲(chóng)屬于微粒子蟲(chóng)屬（Ameson）、八孢子蟲(chóng)屬（Agmasoma）和匹里蟲(chóng)屬（Pleistophora）[3]。Han等[7]發(fā)現(xiàn)一種可感染馬達(dá)加斯加、莫桑比克和沙特阿拉伯地區(qū)白對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的新微孢子蟲(chóng)（Perezia sp.），在對(duì)蝦肌肉、肝胰腺、鰓、心臟和淋巴器官組織中有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物和成熟孢子，受感染蝦的尾部呈現(xiàn)不透明或白色。在對(duì)蝦疾病中，微孢子蟲(chóng)病是由原生動(dòng)物所引起的對(duì)蝦病害中較為嚴(yán)重的一種。

EHP隸屬于微孢子蟲(chóng)目（Microsporidia）、微孢子蟲(chóng)科（Nosematidae）、腸胞蟲(chóng)屬（Enterocytozoon），是一種個(gè)體較小的微孢子蟲(chóng)，可在對(duì)蝦細(xì)胞內(nèi)形成對(duì)自身起保護(hù)作用的孢原質(zhì)。EHP從早期孢子的孢原質(zhì)到成熟孢子都在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中生長(zhǎng)發(fā)育。多核的孢子孢原質(zhì)表面有許多液泡，在早期的孢原質(zhì)發(fā)育過(guò)程中發(fā)生了孢原質(zhì)細(xì)胞核二分裂，在孢原質(zhì)中形成了大量前孢子細(xì)胞。在孢原質(zhì)表面形成早期孢子之前，孢原質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中形成電子致密盤和極管的前體。成熟孢子呈橢圓形，大小0.7 μm×1.1 μm，包含1個(gè)細(xì)胞核、5～6圈極絲、1個(gè)后液泡、1個(gè)附著在極絲上的固著盤，以及厚的高電子密度胞壁。胞壁由原生質(zhì)膜、低電子密度孢子內(nèi)壁（10 nm）和高電子密度孢子外壁（2 nm）組成[1]。

2 感染宿主和傳播途徑

對(duì)蝦多通過(guò)捕食被微孢子蟲(chóng)寄生的其他動(dòng)物而感染，所以微孢子蟲(chóng)常在野生對(duì)蝦中發(fā)生，如褐對(duì)蝦（Penaeus agtecus）和白對(duì)蝦（Penaeus setiferus）等[8-9]。我國(guó)在養(yǎng)殖的日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）、凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）中也檢出了EHP[10]。

EHP的傳播途徑有兩種：一種是垂直傳播，即通過(guò)親蝦傳播給子代；另一種是水平傳播，經(jīng)口攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環(huán)境中的孢子體而感染[11]。EHP感染對(duì)蝦后，先在肝胰腺細(xì)胞內(nèi)形成孢原質(zhì)，待孢子成熟后，再通過(guò)對(duì)蝦消化道排出體外，然后散于水體并附著于藻類、碎屑、飼料表面，以及池壁和底泥環(huán)境中，成為健康對(duì)蝦的潛在威脅。通過(guò)肌肉注射、口服、與EHP陽(yáng)性蝦同池飼養(yǎng)等途徑，對(duì)健康蝦進(jìn)行EHP感染試驗(yàn)[12]，發(fā)現(xiàn)該寄生蟲(chóng)具有非常強(qiáng)的傳染性，可通過(guò)多途徑傳播，能在蝦的消化器官細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，吸收營(yíng)養(yǎng)，從而影響肝胰腺和腸道的正常消化吸收功能，使被寄生的蝦類生長(zhǎng)發(fā)育受阻礙，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致其生長(zhǎng)停止。

3 癥狀及病理變化

對(duì)蝦感染EHP后不表現(xiàn)出明顯的疾病癥狀，攝食正常，腸胃充滿食物，不出現(xiàn)大批死亡，嚴(yán)重時(shí)腸道發(fā)炎，肝胰腺萎縮、發(fā)軟，顏色變深，個(gè)別病蝦可排白便。發(fā)病對(duì)蝦生長(zhǎng)速度緩慢或停滯，但個(gè)體差異大，50%～60%的對(duì)蝦體重停滯在4～5 g，直至養(yǎng)殖周期結(jié)束[5]。天津、浙江和山東等地的研究表明：同樣大小的凡納濱對(duì)蝦，EHP陽(yáng)性群的平均體重比陰性群低30%；EHP陽(yáng)性群中的凡納濱對(duì)蝦體長(zhǎng)和體重變異系數(shù)分別是陰性群的（2.39±0.93）和（2.05±0.86）倍，表現(xiàn)為陽(yáng)性群個(gè)體大小不均勻；EHP陽(yáng)性群體重偏差率是陰性群的2.34～3.45倍；體長(zhǎng)相同時(shí)，EHP陽(yáng)性蝦的體重波動(dòng)變大[13]。2014—2015年劉珍等[10]對(duì)江蘇、海南、山東等地的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：EHP的載量指數(shù)與對(duì)蝦生長(zhǎng)速率呈負(fù)相關(guān)；肝胰腺中的EHP載量在103copies/（ng HpDNA）數(shù)量級(jí)或EHP載量指數(shù)在3以上時(shí)，對(duì)蝦生長(zhǎng)明顯變慢，代表了較高的風(fēng)險(xiǎn)水平。

剖檢浙江省感染EHP凡納濱對(duì)蝦的鰓絲和肌肉組織，未見(jiàn)明顯病理變化，但發(fā)現(xiàn)肝胰腺組織病變嚴(yán)重，肝胰腺腔體變小或消失，細(xì)胞腫大，膜結(jié)構(gòu)模糊；肝胰腺上皮細(xì)胞腫大，界線模糊，細(xì)胞核壞死、消失；肝胰腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死或脫落；在病蝦肝胰腺中可觀察到EHP的孢子顆粒，大小為（1.3±0.2）μm×（0.8±0.2）μm；肝胰腺小管上皮細(xì)胞有嗜堿性的孢原質(zhì)和不同發(fā)育階段的孢子[5]。Kathy等[12]研究發(fā)現(xiàn)：EHP寄生在蝦腸細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可引起腸壁發(fā)炎；印度尼西亞患白便綜合征（White feces syndrome，WFS）的凡納濱對(duì)蝦甲殼松弛，后腸呈白色；在對(duì)蝦白色糞便中檢測(cè)出密集的EHP孢子和數(shù)量較少的桿狀細(xì)菌；感染EHP的對(duì)蝦可伴有敗血性肝胰腺壞死（SHPN），中腸上皮細(xì)胞也可被EHP感染，因此EHP感染的組織類型較多。

試驗(yàn)表明，感染EHP病蝦血淋巴中的總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）等反映肝胰腺功能的生物化學(xué)參數(shù)數(shù)值均比健康蝦高得多[14]。肝胰腺病變致使肝胰腺功能受損。

4 EHP致病性

EHP感染往往伴隨著弧菌的繼發(fā)感染。EHP是對(duì)蝦急性肝胰腺壞死（AHPND）和敗血性肝胰腺壞死（SHPN）的一個(gè)危險(xiǎn)因素。AHPND又稱早期死亡癥（EMS），其病原是一種特異的常見(jiàn)革蘭氏陰性菌——嗜鹽的副溶血性弧菌；SHPN病原為革蘭氏陰性，是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的肝胰腺壞死性細(xì)菌，分散存在于感染的肝胰腺細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。兩者均表現(xiàn)為肝胰腺壞死和高死亡率。EHP感染增強(qiáng)了對(duì)蝦AHPND、SHPN感染的敏感性，加重了肝胰腺細(xì)胞的壞死和脫落，提高了對(duì)蝦急性肝胰腺壞死（AHPND）和敗血性肝胰腺壞死（SHPN）的死亡率[15]。

EHP感染可導(dǎo)致蝦免疫力降低，繼而由水體中的條件致病菌引起繼發(fā)感染，出現(xiàn)腸炎、組織壞死、紅體等病癥。Biju等[2]從2014年3月至2015年4月在印度坦米爾泰、安德拉邦和奧里薩邦采集生長(zhǎng)緩慢、低死亡率的235個(gè)池塘的對(duì)蝦樣品進(jìn)行EHP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦有高發(fā)病率，并伴有細(xì)菌感染。據(jù)泰國(guó)學(xué)者報(bào)道，泰國(guó)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦感染EHP時(shí)，雖然表現(xiàn)為WFS，但WFS與EHP感染沒(méi)有直接的因果關(guān)系[11]。

除EHP外，傳染性皮下和造血組織壞死病毒（Infections hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）也是導(dǎo)致養(yǎng)殖對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的主要病原。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》中，將該病定為須向其申報(bào)的甲殼類疾病之一。IHHNV感染凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、細(xì)角濱對(duì)蝦后，引起病蝦生長(zhǎng)遲緩，出現(xiàn)畸形，呈現(xiàn)出慢性感染癥狀，即慢性矮小殘缺綜合癥（Runtdeformity syndrome，RDS）。病蝦觸角、額劍、頭胸部及腹部甲殼等位置均出現(xiàn)不同程度病變；患病幼蝦表現(xiàn)為額劍和觸角彎曲、變形，甲殼粗糙無(wú)光澤或殘缺等病變[16]。因此，應(yīng)及時(shí)對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦進(jìn)行檢驗(yàn)檢疫，盡快確定病原，從而進(jìn)行有針對(duì)性的病害防控。

目前，白斑病毒（WSSV）對(duì)中國(guó)對(duì)蝦有很強(qiáng)的致病力。受感染的蝦常發(fā)生全身性病變，使蝦體更易于遭受其他病原體的侵害。中國(guó)對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后，可使仔蝦的微孢子蟲(chóng)敏感性增加，使對(duì)蝦微孢子蟲(chóng)感染率達(dá)90%以上[17]。如果多種養(yǎng)殖對(duì)蝦病害并發(fā)，危害將更大，應(yīng)引起養(yǎng)殖單位的警惕。

5 檢測(cè)方法

EHP比一般的微孢子蟲(chóng)小，且不形成肉眼可見(jiàn)的胞囊；感染EHP的對(duì)蝦不表現(xiàn)特征性臨床癥狀。因此，需要在實(shí)驗(yàn)室采用組織學(xué)或分子生物學(xué)方法確診EHP。

5.1 組織學(xué)方法

組織學(xué)方法是通過(guò)組織切片，HE染色，顯微觀察，揭示疾病引起的組織病理變化及器官損傷機(jī)制的方法，可診斷疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，為病原的致病機(jī)制研究及有效防治提供理論依據(jù)。Tourtip等[1]根據(jù)微孢子蟲(chóng)屬的超微結(jié)構(gòu)特征，胞原質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的位置，SSU rRNA序列與微孢子蟲(chóng)屬基因組（GenBank FJ496356）比對(duì)同源性（84%），首次分離出EHP。但組織學(xué)方法檢驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，當(dāng)病原含量低或處于潛伏期時(shí)，容易漏診或誤診，因此需結(jié)合分子生物學(xué)方法做出明確診斷。

5.2 分子生物學(xué)方法

目前，國(guó)內(nèi)外已有多種分子生物學(xué)方法用于檢測(cè)EHP。

5.2.1 原位雜交技術(shù)（In situ hybridization，ISH） 利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性外源核酸（即探針）與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，然后經(jīng)檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)[5]。Tang等[18]采用原位雜交方法，特異性檢出對(duì)蝦組織、糞便和養(yǎng)殖水體中的EHP。雷燕等[20]根據(jù)GenBank中對(duì)蝦腸道上皮細(xì)胞的EHP基因保守序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，建立了EHP PCR方法。該法僅對(duì)EHP的基因組片段進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，得到300 bp特異性擴(kuò)增條帶，最低可檢測(cè)出約100 fg的EHP基因組DNA，可用于EHP感染初期或處于潛伏期幼蝦、親蝦，以及池塘底泥、水質(zhì)的檢測(cè)。

5.2.2 套式PCR（nested PCR） 通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)，來(lái)增強(qiáng)檢測(cè)的特異性和敏感性。Amornrat等[11]利用套式PCR檢測(cè)方法，開(kāi)展了EHP診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。Suebsing等[20]應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）結(jié)合熒光納米金（AuNP）探針標(biāo)記的方法檢測(cè)EHP。該方法具有儀器設(shè)備要求低、結(jié)果判定簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。它（0.02 fg總DNA）比傳統(tǒng)的套式PCR（0.2 fg總DNA）更敏感，適用于現(xiàn)場(chǎng)小型實(shí)驗(yàn)室對(duì)親蝦、蝦苗的篩選和對(duì)蝦飼養(yǎng)期間的EHP監(jiān)測(cè)。

5.2.3 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法 通過(guò)對(duì)DNA模板的定量，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的檢測(cè)，對(duì)分析微孢子蟲(chóng)載量和開(kāi)展病原防控研究具有重要意義。駱云慧等[21]發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)EHP標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度為5.20×102copies/μL，比常規(guī)PCR高10倍；從樣品核酸提取到檢驗(yàn)完成，整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)只需2 h，大大提高了EHP檢測(cè)效率，可滿足高通量檢測(cè)。劉珍等[10]對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中的引物濃度、探針濃度、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了EHP的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度下限為8.3×101copies/μL。該方法靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)單，適用于親蝦、苗種的快速檢測(cè)。篩選簡(jiǎn)單易行、靈敏準(zhǔn)確的EHP檢測(cè)方法可為EHP早期預(yù)防控制和對(duì)蝦無(wú)特定病原（SPF）種群的選育提供參考依據(jù)。

6 防控措施

在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖水體、養(yǎng)殖工具，以及飼喂鮮活餌料等環(huán)境因素的嚴(yán)格把關(guān)，對(duì)控制對(duì)蝦EHP感染極為重要。陳祿芝[4]在未經(jīng)處理的海水樣品中檢測(cè)到EHP，而在經(jīng)過(guò)砂濾、臭氧消毒、精密過(guò)濾、紫外消毒等一系列處理過(guò)的水體中未檢測(cè)出EHP，可見(jiàn)消毒處理可以預(yù)防EHP感染和傳播。

對(duì)蝦EHP的控制需要依靠預(yù)防手段，主要包括：（1）加強(qiáng)苗種檢疫，選擇不帶病原的苗種。養(yǎng)殖戶在購(gòu)苗時(shí)應(yīng)主動(dòng)抽樣，委托具有資質(zhì)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)，采購(gòu)檢驗(yàn)合格的苗種。（2）對(duì)于曾經(jīng)發(fā)生過(guò)對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的養(yǎng)殖池塘，應(yīng)采集有代表性的底泥進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于EHP陽(yáng)性的底質(zhì)必須進(jìn)行嚴(yán)格的清塘滅孢。（3）車間水泥池應(yīng)徹底消毒，清洗干凈，晾干。（4）合理設(shè)置進(jìn)排水系統(tǒng)。對(duì)于浮水井或外海水，需經(jīng)砂濾、蓄水池沉淀、曝氣、消毒等處理后方可使用；池塘排換的養(yǎng)殖尾水，需經(jīng)無(wú)害化處理后再排放，防止病原在不同養(yǎng)殖池塘或養(yǎng)殖場(chǎng)間傳播。

近年來(lái)，EHP的流行和傳播對(duì)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重影響，已成為導(dǎo)致對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的主要病原。盡快建立病害生物防控關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境保護(hù)，繁育SPF對(duì)蝦苗種，改進(jìn)EHP檢測(cè)技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)控疫情，可有效保障對(duì)蝦養(yǎng)殖的健康發(fā)展。

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