多囊卵巢綜合征大鼠AMH 表達(dá)與胰島素抵抗的相關(guān)性研究

李曉紅 閆 宏 溫泰芳 (深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院生殖內(nèi)分泌科，深圳518172)

PCOS 是一種內(nèi)分泌障礙性疾病，主要發(fā)生在育齡期婦女，發(fā)病原因及機(jī)理目前尚不明確，臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性的特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、排卵障礙和不孕，主要內(nèi)分泌特征為高雄激素及高胰島素血癥，AMH 是反映多囊卵巢綜合征的一個(gè)重要的激素，是卵巢局部的一種重要的調(diào)節(jié)因子，有學(xué)者研究認(rèn)為AMH 水平隨著雄激素的升高而變化［1］，另有學(xué)者研究認(rèn)為PCOS 患者胰島素抵抗程度與雄激素水平呈相關(guān)性［2］。而AMH 與IR 是否有相關(guān)性目前報(bào)道相對(duì)較少，本研究采用RT-PCR 法探討多囊卵巢綜合征大鼠AMH 表達(dá)與胰島素抵抗的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 SD 雌性大鼠60 只，隨機(jī)選擇40只采用DHEA 皮下注射法制作PCOS 大鼠模型，作為實(shí)驗(yàn)組;20 只正常SD 雌鼠作為對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCOS 模型制作 23 日齡左右的SD 大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg·d)，具體方法如下:將DHEA 溶于0.2 ml 甘油中，對(duì)照組皮下注射0.2 ml甘油，均于上午10 時(shí)連續(xù)皮下注射21 d;空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)，停藥后，連續(xù)陰道涂片7 d，藥物注射結(jié)束后，根據(jù)大鼠陰道上皮細(xì)胞是否存在周期性的變化來判定是否造模成功。

1.2.2 相關(guān)激素指標(biāo)測(cè)定 對(duì)造模成功的大鼠及正常對(duì)照大鼠通過陰道涂片觀察周期性變化，選擇動(dòng)情間期的大鼠作為研究對(duì)象，晚上8∶ 00 禁食后，并稱取體重，第二天通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟取血6～10 ml，血樣靜置30 min，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，提取上清液。采用放射免疫法測(cè)定血清黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH);采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定空腹血糖值(Fasting blood glucose，F(xiàn)PG)、血胰島素(Fins)和AMH;采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清E2、PT。根據(jù)HOMA-IR 的計(jì)算公式(HOMA-IR=FPG × FINS/22.5)計(jì)算HOMA-IR 指數(shù)值。所有PCOS 模型均經(jīng)過病理證實(shí)為PCOS 大鼠，根據(jù)HOMA-IR 值由大到小排列順序，前20 只與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明為PCOS合并IR 組;后20 只與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，判定為PCOS 無IR 組;對(duì)照組20 只。

1.2.3 標(biāo)本采集及病理檢測(cè) 對(duì)已經(jīng)采集血清的大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢解剖，盡量將卵巢周圍的附帶組織去除干凈后置于10%甲醛液中，固定24 h 后進(jìn)行切片，厚度4 mm，切取卵巢的最大平面進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，分別切取3 片，2 片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，1 片進(jìn)行HE 染色形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.4 免疫組化檢測(cè) 根據(jù)DAB 試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)濃度為1∶ 20，AMH 受體表達(dá)陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為在細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或棕褐色顆粒出現(xiàn)，采用image analysis-microarray 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)選擇2 000 倍視野下的5個(gè)單卵泡視野，半定量分析AMH 的表達(dá)水平。陽性單位(PU)=(待測(cè)部分的平均灰度-背景平均灰度)/ 256 ×100，256 為檢測(cè)高倍鏡的最大灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)和方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采取秩和檢驗(yàn)，對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析和直線回歸分析。P＜0.05 判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 從表1 中可以看出單純PCOS 組、PCOS 合并IR 組和對(duì)照組FSH、FPG 相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);PCOS 大鼠無論是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明顯高于對(duì)照組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而PCOS 合并IR 組T、Flns 及HOMA-IR 較對(duì)照組明顯升高，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 三組血清AMH、卵巢局部AMH 及胰島素受體表達(dá)、單卵泡AMH 及胰島素受體表達(dá)比較 從表2中可以看出PCOS 大鼠無論是否合并IR 血清AMH、卵巢局部AMH 均高于對(duì)照組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PCOS 合并IR 組明顯高于單純PCOS 組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);三組間卵巢局部胰島素受體、單卵泡AMH 及單卵泡胰島素受體相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 AMH 與胰島素、胰島素受體表達(dá)相關(guān)性分析 經(jīng)過Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示血清AMH 表達(dá)強(qiáng)度與胰島素表達(dá)強(qiáng)度無明顯相關(guān)性(r=0.015，P ＞0.05);卵巢局部AMH 表達(dá)與胰島素受體有明顯相關(guān)性(r=0.671，P=0.003);單卵泡AMH 表達(dá)強(qiáng)度與胰島素受體表達(dá)強(qiáng)度無明顯相關(guān)性(r=0.011，P ＞0.05);而對(duì)血清AMH 的表達(dá)與HOMA-IR 進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示HOMA-IR 與血清AMH 之間存在明顯的正相關(guān)性(r=0.683，P=0.001)。

表1 三組血清學(xué)指標(biāo)比較Tab.1 Compares three groups of serological markers

表2 三組空腹胰島素、卵巢局部AMH 及胰島素受體表達(dá)、單卵泡AMH 及胰島素受體表達(dá)比較Tab.2 Three fasting insulin，insulin receptor expression in local AMH and ovarian follicle single AMH and insulin receptor expression in comparison

2.4 血清AMH 與HOMA-IR、血清T 及胰島素多元回歸分析 經(jīng)過逐步回歸篩選，血清T 不符合回歸方程，變量HOMA-IR 和胰島素符合回歸方程，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=12.37，P=0.000 1，因此血清AMH與HOMA 指數(shù)和血清胰島素之間可能存在直線關(guān)系，將其代入多元回歸方程AMH=15.676 HOMAIR+4.683 FINS -72.112，兩變量的偏回歸系數(shù)分別為15.661 和4.682，因此，HOMA-IR 對(duì)血清AMH的影響與胰島素相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

PCOS 是育齡期婦女常見的一種疾病，主要特征為排卵障礙、高雄激素血癥、胰島素抵抗及卵巢多囊性改變，發(fā)病率為5%～10%，但發(fā)病原因及機(jī)理目前尚不明確。AMH 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的一員，是一種二聚體糖蛋白，高表達(dá)于卵巢竇前卵泡和小竇狀卵泡上，女性開始青春期發(fā)育時(shí)，AMH 的表達(dá)水平已經(jīng)開始逐步上升，最終到達(dá)基礎(chǔ)水平，該水平維持整個(gè)生育期。PCOS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)中無AMH的相關(guān)說明，但從眾多的研究中發(fā)現(xiàn)AMH 在PCOS的代謝功能紊亂及相關(guān)遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中有不可忽視的作用。有學(xué)者研究認(rèn)為PCOS 患者AMH 水平較正常女性高2～3 倍［3］。

本研究結(jié)果顯示PCOS 大鼠無論是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明顯高于對(duì)照組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而PCOS 合并IR 組T、Flns 及HOMA-IR 較對(duì)照組明顯升高，相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

PCOS 大鼠血清AMH 升高可能是導(dǎo)致排卵障礙的原因之一，可能機(jī)理是與正常卵巢相比PCOS卵巢存在較多的停滯不前的竇前卵泡，因此，AMH分泌增多，導(dǎo)致卵泡發(fā)育及排卵障礙，進(jìn)而導(dǎo)致更多的不成熟卵泡，AMH 分泌也逐漸增多。有學(xué)者研究表明PCOS 患者血清中AMH 表達(dá)水平與雄激素和胰島素水平呈正相關(guān)［4］。本研究結(jié)果顯示:PCOS大鼠無論是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明顯高于對(duì)照組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表現(xiàn)為代償性胰島素升高(CHI)，而空腹血糖無顯著差異。有學(xué)者研究顯示胰島素升高能夠促進(jìn)卵泡募集［5］，卵泡募集導(dǎo)致小竇卵泡和竇前卵泡增多，進(jìn)而增加AMH 分泌，而AMH 具有抑制顆粒細(xì)胞芳香化酶的作用，進(jìn)而降低卵泡對(duì)FSH 的敏感性，雄激素的合成增加，最終導(dǎo)致小竇卵泡數(shù)目增多，AMH的產(chǎn)生相應(yīng)也增多。上述結(jié)果說明:AMH 和胰島素相互作用可能是導(dǎo)致PCOS 患者雄激素升高的原因，三者之間可能具有相互作用、相互影響的關(guān)系。

目前對(duì)于PCOS 患者單個(gè)卵泡AMH 水平各個(gè)學(xué)者無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有學(xué)者研究表明PCOS 患者單個(gè)卵泡AMH 會(huì)顯著升高［1］，另有學(xué)者認(rèn)為AMH 的水平只是與小卵泡的數(shù)量有關(guān)，而單個(gè)卵泡分泌AMH 的水平無明顯改變［6］。從臨床治療的結(jié)果上也可以看出，采用胰島素增敏劑治療PCOS 患者，可以有效降低高胰島素血癥，減少竇前卵泡的數(shù)量，從而改善胰島素抵抗［7］，而長(zhǎng)期的二甲雙胍治療是否能夠降低AMH 水平還有待于進(jìn)一步觀察［8］。本研究結(jié)果顯示，PCOS SD 大鼠單個(gè)卵泡AMH 表達(dá)水平與正常大鼠AMH 表達(dá)相比差異不明顯?？赡苁怯捎谠诼雅菰缙冢奂に氐乃缴?，導(dǎo)致多個(gè)小卵泡生長(zhǎng)，卵泡的數(shù)量增加，但單個(gè)卵泡表達(dá)的AMH 水平無變化，但是隨著小卵泡數(shù)量的不斷增多，卵巢局部AMH 水平表達(dá)增多，胰島素受體也增多［9］。

胰島素受體在卵泡細(xì)胞膜表面及間質(zhì)均有表達(dá)，對(duì)卵巢功能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，胰島素代謝紊亂［10］。早期認(rèn)為PCOS 代償性高胰島素將降調(diào)節(jié)胰島素受體數(shù)目，胰島素抵抗可能是由于胰島素受體數(shù)目減少引起。本研究結(jié)果顯示，PCOS 大鼠與對(duì)照組相比，卵巢局部和單卵泡胰島素受體表達(dá)無差異，單卵泡AMH水平與胰島素受體表達(dá)無相關(guān)性，卵巢局部AMH表達(dá)與胰島素受體呈明顯相關(guān)性，因此，可以推測(cè)PCOS 卵巢局部AMH 的高表達(dá)可能與高胰島素血癥具有相關(guān)性，在AMH 與胰島素受體的相互作用下雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化受到阻滯，與高雄激素血癥之間形成正反饋調(diào)節(jié)作用［1］。

總之，PCOS 大鼠AMH 與血清胰島素水平呈正相關(guān)，卵巢局部AMH 表達(dá)與胰島素受體有正相關(guān)性，而單卵泡AMH 表達(dá)與胰島素受體無明顯相關(guān)性，對(duì)于是否與高雄激素有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。

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