不同中藥制劑微生物限度檢查方法學(xué)的研究

李思 易偉 吳晶晶

[摘要] 目的 建立9種中藥制劑的微生物限度檢查方法。 方法 按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1100生物檢查法進(jìn)行微生物限度檢查方法的建立和驗(yàn)證。 結(jié)果 分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法，各試驗(yàn)菌樣品中的回收率均在0.5～2.0，符合《中國(guó)藥典》要求。 結(jié)論 建立的方法準(zhǔn)確可靠，可用于9種中藥制劑的微生物限度檢查。

[關(guān)鍵詞] 中藥制劑；微生物限度檢查法；方法驗(yàn)證；抑菌作用

[中圖分類號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）09（c）-0098-04

[Abstract] Objective To establish the microbial limit test for 9 kinds of traditional Chinese medicine preparations. Methods According to the Chinese Pharmacopeia 2015 edition 4th part general rule 1100 biological examination method， the microbial limit test method was established and verified. Results By using normal method， medium dilution method and membrane filtration method respectively， the recovery rate of each test bacteria sample was both up to 0.5-2.0， which met the Chinese Pharmacopeia requirements. Conclusion The established method is accurate and reliable， which can be used for the microbial limit test of 9 kinds of traditional Chinese medicine preparations.

[Key words] Traditional Chinese medicine preparation； Microbial limit test； Method validation； Antibacterial effect

口服中藥制劑的微生物污染情況是其質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，因此藥品微生物檢驗(yàn)和控制是其安全性保障的一項(xiàng)重要措施[1]。2015年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法[2]參照美國(guó)藥典[3]進(jìn)行修訂，在檢驗(yàn)內(nèi)容、檢驗(yàn)方法和培養(yǎng)體系上都有很大改變[4-5]，新的微生物限度檢查方法需要再次驗(yàn)證。

本研究按照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1100生物檢查法[2]的要求，分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法對(duì)9種中藥制劑進(jìn)行微生物限度檢查方法學(xué)的驗(yàn)證，從而保證用藥的安全性和有效性，同時(shí)也希望為檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)采用2015版《中國(guó)藥典》進(jìn)行微生物限度檢查和微生物質(zhì)量分析提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PYX-DHS-40×50型隔水式電熱恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PYX-DHS.500-BS型隔水式電熱恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；MJ-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海恒科有限公司）；SQ510C型立式壓力蒸汽滅菌器（雅馬拓科技貿(mào)易有限公司）；蘇Q/WS2-175-79型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）；MP1100B型電子天平（精密度：0.01 g，上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；MP2001型電子天平（精密度：0.01 g，上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；勻漿儀；開放式過濾器；雙人操作臺(tái)。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]。以上菌株均為第3代，均購(gòu)自江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151028），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151103），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151022），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151022），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1511092），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：1511092），腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151112），紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151109），RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151028），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151027），蛋白胨（批號(hào)：141023）。上述培養(yǎng)基均為北京三藥科技開發(fā)公司產(chǎn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院監(jiān)制，均購(gòu)自江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所。

1.4 試藥

益腎丸（A，批號(hào)：160504、160510、160613），川丹靈膠囊（B，批號(hào)：151216、151224、151228），升血靈片（C，批號(hào)：160106、160304、160417），胃樂舒顆粒（D，批號(hào)：160616、160709、160811），氣血雙補(bǔ)口服液（E，批號(hào)：160720、160801、160822），消脂平片（F，批號(hào)：150827、151010、151229），腎炎寧片（G，批號(hào)：160715、160811、160909），復(fù)膽片（H，批號(hào)：160607、160711、160809），金保腎片（I，批號(hào)：151017、151223、160111），均由南京總醫(yī)院制劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌至10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中30～35℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌至10 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中20～25℃培養(yǎng)48 h；接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上20～25℃培養(yǎng)7 d，再用5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（稀釋劑）將孢子洗脫，并過濾孢子至無菌試管內(nèi)。取上述各培養(yǎng)物1 mL，用稀釋劑10倍遞增稀釋，分別制成3000～10 000 cfu/mL的菌懸液（1 mL/皿）和15 000～50 000 cfu/mL的菌懸液（0.2 mL/皿）。

2.2 供試液的制備

2.2.1 計(jì)數(shù)用供試液制備

取供試品10 g或10 mL，加45℃稀釋劑至100 mL，研勻。

2.2.2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查供試液制備

取供試品10 g，至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，研勻。

2.2.3 沙門菌檢查供試液制備

取供試品10 g，至200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，研勻。

2.3 需氧菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.3.1 常規(guī)法（1 mL/皿）

2.3.1.1 菌液組 取“2.1”項(xiàng)下3000～10 000 cfu/mL的菌懸液0.1 mL，加至10 mL稀釋劑中，反復(fù)吹洗。取1 mL注入平皿中，加入約20 mL的培養(yǎng)基，測(cè)定菌落數(shù)。

2.3.1.2 試驗(yàn)組 取“2.1”項(xiàng)下3000～10 000 cfu/mL的菌懸液0.1 mL，加入到10 mL“2.2.1”項(xiàng)下的供試液中，其他操作同菌液組。

2.3.1.3 供試品對(duì)照組 取“2.2.1”項(xiàng)下液體1 mL注入平皿中，加入培養(yǎng)基，測(cè)定供試品的本底菌落數(shù)。

2.3.1.4 陰性對(duì)照組 取稀釋劑1 mL分別注入平皿，加入培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照[6-9]。

計(jì)算各試驗(yàn)菌株的回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，A、B、C、D、E可用常規(guī)法進(jìn)行檢查。F、G、H和I具有一定的抑菌性，需重新驗(yàn)證。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）

2.3.2.1 菌液組 取“2.1”項(xiàng)下15 000～50 000 cfu/mL的菌懸液0.1 mL，加入到10 mL稀釋劑中，反復(fù)吹洗。取0.2 mL注入平皿中，加入約20 mL的培養(yǎng)基，測(cè)定菌落數(shù)。

2.3.2.2 試驗(yàn)組 取“2.1”項(xiàng)下15 000～50 000 cfu/mL的菌懸液0.1 mL，加入到10 mL“2.2.1”項(xiàng)下的供試液中，其他操作同菌液組。

2.3.2.3 供試品對(duì)照組 取“2.2.1”項(xiàng)下液體0.2 mL注入平皿，加入培養(yǎng)基，測(cè)定供試品的本底菌落數(shù)。

2.3.2.4 陰性對(duì)照組 取稀釋劑0.2 mL分別注入平皿，加入培養(yǎng)基[7-8，10]。

計(jì)算各試驗(yàn)菌株的回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）可消除F的抑菌性，但G、H和I需采用薄膜過濾法重新驗(yàn)證。

2.3.3 薄膜過濾法

2.3.3.1 試驗(yàn)組 取“2.2.1”項(xiàng)下的供試液1 mL加至適量的稀釋液中，混勻，過濾，用0.1%蛋白胨300 mL分3次沖洗濾膜，在最后1次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗(yàn)菌株，取出濾膜，濾膜菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，測(cè)定菌落數(shù)。

2.3.3.2 菌液組 取1 mL稀釋劑代替供試品，其他操作同試驗(yàn)組。

2.3.3.3 供試品對(duì)照組 除不加試驗(yàn)菌外，其他操作同試驗(yàn)組。

2.3.3.4 陰性對(duì)照組 取1 mL稀釋劑代替供試品，不加試驗(yàn)菌，其他操作同試驗(yàn)組[11-12]。

計(jì)算各試驗(yàn)菌株的回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，采用薄膜過濾法5種菌種的回收率均在0.5～2.0，故可用薄膜過濾法檢查。

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 大腸埃希菌

2.4.1.1 試驗(yàn)組 取“2.2.1”項(xiàng)下供試液10 mL及不大于100 cfu的大腸埃希菌懸液1 mL，至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，取1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48 h。劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，置30～35℃培養(yǎng)18～72 h。

2.4.1.2 陽性對(duì)照組 用稀釋劑代替供試液，其他操作同試驗(yàn)組。

2.4.1.3 陰性對(duì)照組 用稀釋劑代替供試液，不加試驗(yàn)菌，其他操作同試驗(yàn)組。結(jié)果見表4。

2.4.2 耐膽鹽革蘭陰性菌

2.4.2.1 試驗(yàn)組 取“2.2.2”項(xiàng)下供試液，加入不大于100 cfu的大腸埃希菌（銅綠假單胞菌），混勻，20～25℃培養(yǎng)約2 h。再用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋成1∶10、1∶100和1：1000供試液。分別取1∶10、1∶100和1∶1000供試液1 mL，分別加至10 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48 h后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，置30～35℃培養(yǎng)18～24 h。

2.4.2.2 陽性對(duì)照組 用稀釋劑代替供試液，其他操作同試驗(yàn)組。

2.4.2.3 陰性對(duì)照組 用稀釋劑代替供試液，不加試驗(yàn)菌，其他操作同試驗(yàn)組。結(jié)果見表4。

2.4.3 沙門菌

2.4.3.1 試驗(yàn)組 取“2.2.3”項(xiàng)下供試液，加入不大于100 cfu的沙門菌，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，取0.1 mL接種于10 mL RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，置30～35℃培養(yǎng)18～48 h。

2.4.3.2 陽性對(duì)照組 用稀釋劑代替供試液，其他操作同試驗(yàn)組。

2.4.3.3 陰性對(duì)照組 用稀釋劑代替供試液，不加試驗(yàn)菌，其他操作同試驗(yàn)組。由表4可見，試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組能正常檢出，陰性對(duì)照未檢出，所以該方法可行。

3 討論

本文按照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1100生物檢查法[2]要求，確立了9種中藥醫(yī)院制劑的微生物限度檢查方法。其中，F(xiàn)、G、H和I均具有一定的抑菌性。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)中含有黃芪、丹參。丹參酮類化合物對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抗菌活性[13-14]。而黃芪對(duì)15種常見細(xì)菌具有一定的抑菌活性[15]。H中含有銀杏葉，銀杏葉對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用[16]。G和I中含有大黃，研究表明，大黃中的蒽醌類對(duì)葡萄球菌、鏈球菌有顯著抗菌活性，同時(shí)大黃對(duì)幽門螺桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙眼衣原體等均有抑制作用[17-19]。

《中國(guó)藥典》2010年版驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)組是將試驗(yàn)菌和供試液同時(shí)加在平皿中，而2015年版是將一定濃度的菌加到供試液中混勻，再取定量的混合液到平皿中，這樣更能模擬真實(shí)的藥物受微生物污染的狀態(tài)。

《中國(guó)藥典》2015年版不再收載“離心沉淀法”，也有研究表明離心沉淀會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響[20]，因此本文采用薄膜過濾法。實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)取相當(dāng)于1 g樣品的供試液（即10 mL）進(jìn)行薄膜過濾，但是由于中藥固體制劑中含有大量的飲片細(xì)粉、輔料，直接過濾容易導(dǎo)致濾膜堵塞，而且濾膜上的中藥殘?jiān)鼘?dǎo)致菌落計(jì)數(shù)無法進(jìn)行。因此本文將取樣量改為相當(dāng)于0.1 g樣品的供試液（即1 mL）進(jìn)行試驗(yàn)，過濾效果較為理想，菌落計(jì)數(shù)也能順利進(jìn)行。

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（收稿日期：2018-03-08 本文編輯：張瑜杰）