劉靜,陳振江,李秀璋,周景樂,柳莉,李春杰
(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)
醉馬草(Achnatheruminebrians)是禾本科芨芨草屬多年生草本植物,是我國西北天然草場主要的烈性毒草之一;主要分布在我國甘肅,內(nèi)蒙古,青海,西藏等地[1],且調(diào)查發(fā)現(xiàn),這幾個(gè)地方醉馬草內(nèi)生真菌的帶菌率都很高,近100%[2-3]。禾草內(nèi)生真菌是指在禾草體內(nèi)度過大部分或者全部生命周期,但卻不會(huì)引起禾草外部顯示任何病害癥狀的一大類真菌[4]。大量研究表明,內(nèi)生真菌的侵染能顯著提高醉馬草的耐鹽性[5]、耐旱性[6]、抗病性[6-7]和抗蟲性[8]等。但有關(guān)內(nèi)生真菌提高宿主抗寒性的報(bào)道不多見。
低溫是影響植物生長發(fā)育主要的非生物因素之一。研究表明低溫條件下種子萌發(fā)率降低、幼苗生長緩慢[9]和植物的膜系統(tǒng)發(fā)生變化,從而影響脂肪酸的組分與膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性[10-11]。此外,低溫對(duì)植物生理生化的影響主要是影響光合作用[12-14]、酶活性[15-17]和細(xì)胞中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等[18-19]。近年來有關(guān)外源激素與植物抗寒性的報(bào)道很多[20-21]。激素種類繁多,對(duì)植物的作用也各不相同,抗寒性方面研究較多的激素為脫落酸(abscisic acid, ABA)[22]和水楊酸(salicylic acid, SA)[23]。ABA具有抑制種子萌發(fā)、促進(jìn)胚胎成熟、葉脫落和衰老等生理作用[24],在植物低溫、干旱、鹽漬等脅迫中有著重要的作用[25-27],植物處于低溫條件時(shí),外施ABA可提高可溶性糖的含量、SOD和POD活性,從而提高植物的耐寒水平[28]。陳善娜等[29]用5~10 mol·L-1的ABA噴施低溫脅迫2~4 d的水稻(Oryzasativa)兩葉期幼苗,結(jié)果顯示,清除自由基的超氧化物歧化酶活性和過氧化物酶活性增加,丙二醛含量減少,從而說明外源ABA能明顯增強(qiáng)光下水稻幼苗自由基清除能力,加強(qiáng)水稻的耐寒性。SA即鄰經(jīng)基苯甲酸,是植物體內(nèi)普遍存在的一類小分子物質(zhì),在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,如參與植物種子萌發(fā)、氣孔開閉、光合和呼吸等作用[30]。另外,有研究表明,植物在遭受低溫脅迫時(shí),外源SA預(yù)處理可提高養(yǎng)心菜(Sedumaizoon)和溝葉結(jié)縷草(Zoysiamatrella)中的抗氧化酶活性,增強(qiáng)他們對(duì)低溫脅迫的抵抗[31-32]。然而有關(guān)低溫條件下,內(nèi)生真菌和外源激素互作對(duì)醉馬草生理、生化的影響尚未見報(bào)道。因此,本研究以醉馬草幼苗為研究對(duì)象,噴灑濃度為1.5 mmol·L-1的SA和0.1 mmol·L-1的ABA,研究其對(duì)Chl含量、MDA含量、保護(hù)性酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響,探討外源激素與內(nèi)生真菌互作對(duì)醉馬草幼苗低溫下生長的影響,初步為醉馬草低溫生長的研究提供理論依據(jù)。
1.1.1種子和外源激素來源 帶內(nèi)生真菌(E+)和不帶內(nèi)生真菌(E-)醉馬草種子均采集于蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院榆中田間試驗(yàn)地(E 104°08′,N 35°56′,海拔1514 m)。
水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)由上海中秦化學(xué)試劑有限公司和天津光復(fù)精細(xì)化工研究所分別提供。
1.1.2幼苗的種植 按照李春杰等[33]的檢測方法將上述收集到的E+、E-醉馬草種子進(jìn)行進(jìn)一步檢測,驗(yàn)證種子帶內(nèi)生真菌的情況;先用75%的酒精表面消毒5 min,再用1%次氯酸鈉消毒10 min,最后用無菌水沖洗干凈,在雙層濾紙上進(jìn)行發(fā)芽,出芽2 d后將長勢(shì)均勻的幼苗種植于16 cm (上口徑)×12 cm (下口徑)×10 cm (高)的花盆中,每盆5株,然后置于25 ℃光暗交替培養(yǎng)箱中進(jìn)行生長,一個(gè)月后開始處理。
1.2.1激素處理 幼苗生長1個(gè)月后,抽樣進(jìn)行內(nèi)生真菌檢測,再次確定帶菌情況,參照前期研究基礎(chǔ)[34],用濃度為1.5 mmol·L-1的SA和0.1 mmol·L-1的ABA分別噴施于醉馬草E+、E-幼苗,分別標(biāo)記為SA+、SA-、ABA+和ABA-,用無菌水噴施醉馬草E+、E-幼苗作為對(duì)照,標(biāo)記為CK+、CK-,每組設(shè)8個(gè)重復(fù),常溫下生長3 d后再噴灑一次,然后將幼苗置于5 ℃光暗交替培養(yǎng)箱中生長,從第0天開始,每隔2 d取一次樣測定生理指標(biāo),共取樣5次。
1.2.2各項(xiàng)生理指標(biāo)的測定 按照李合生[35]《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)》進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定,葉綠素(chlorophyll, Chl)含量采用丙酮浸提法、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法、過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法、脯氨酸(proline acid, Pro)含量采用磺基水楊酸法、丙二醛(malondialdehyde, MAD)含量采用硫代巴比妥酸法、可溶性糖(soluble sugar, SS)含量采用蒽酮法。
采用Microsof Excel 2013錄入數(shù)據(jù)并作圖,采用SPSS 17.0對(duì)外源激素與內(nèi)生真菌互作對(duì)醉馬草幼苗葉綠素含量、丙二醛含量、保護(hù)性酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量分別進(jìn)行雙因素方差分析(ANOVA),對(duì)同一脅迫時(shí)間內(nèi)不同處理間的差異性進(jìn)行單因素方差分析。
隨脅迫時(shí)間的延長,醉馬草幼苗Chl含量整體呈下降的趨勢(shì),且與CK比較,外源激素處理下Chl含量高于CK。CK處理下,E+的Chl含量在脅迫第6天和第8天時(shí)顯著(P<0.05)高于E-(圖1),分別顯著提高了38.1%和22.4%。SA處理下,脅迫第6天和第8天時(shí),SA+、SA-的Chl含量均達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖1),SA+比SA-的Chl含量分別顯著(P<0.05)提高了23.0%和19.7%。ABA處理下,除第0天外,脅迫第2,4,6和8天時(shí),ABA+的Chl含量顯著(P<0.05)高于ABA-(圖1),分別顯著提高了32.2%,31.1%,32.6%和15.2%。
圖1 不同激素處理下葉綠素含量隨時(shí)間的變化Fig.1 The change of chlorophyll content when treated with different hormones 不同字母代表同一脅迫時(shí)間內(nèi)不同處理間的差異顯著性(P<0.05),CK+:帶內(nèi)生真菌幼苗的空白對(duì)照;CK-:不帶內(nèi)生真菌幼苗的空白對(duì)照;SA+:水楊酸處理下帶內(nèi)生真菌的幼苗;SA-:水楊酸處理下不帶內(nèi)生真菌的幼苗;ABA+:脫落酸處理下帶內(nèi)生真菌的幼苗;ABA-:脫落酸處理下不帶內(nèi)生真菌的幼苗,下同。Different letters mean significant difference (P<0.05) among different treatments, CK+: Blank control of endophyte-infected seedling;CK-: Blank control of endophyte-free seedling;SA+: Endophyte-infected seedling were treated by salicylic acid;SA-:Endophyte-free seedling were treated by salicylic acid;ABA+: Endophyte-infected seedling were treated by abscisic acid;ABA-: Endophyte-free seedling were treated by abscisic acid. The same below.
SA或ABA處理下,隨脅迫時(shí)間的延長,醉馬草幼苗MDA含量均呈上升趨勢(shì),且與CK比較,外源激素處理?xiàng)l件下幼苗MDA含量整體低于CK(圖2)。CK處理下,脅迫第6天時(shí),E+、E-的MDA含量均達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖2)。SA處理下,脅迫第6天和第8天時(shí),SA+、SA-的MDA含量達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖2),SA+的MDA含量比SA-分別顯著(P<0.05)降低了25.4%和19.4%。ABA處理下,脅迫第6天和第8天時(shí),ABA-的MDA含量比ABA+分別顯著(P<0.05)提高了21.1%和34.3%。
圖2 不同激素處理下MDA含量隨時(shí)間的變化Fig.2 The change of MDA content when treated with different hormones
2.3.1不同外源激素和內(nèi)生真菌互作對(duì)醉馬草幼苗Pro含量的影響 隨脅迫時(shí)間的延長,醉馬草幼苗Pro含量均呈先升高后降低又升高的趨勢(shì),且與CK比較,外源激素處理下幼苗Pro含量高于CK。CK處理下,脅迫第2,6,8天時(shí),E+、E-的Pro含量達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖3),E+的Pro含量顯著(P<0.05)高于E-,分別提高32.8%,44.2%和23.6%。SA處理下,隨脅迫時(shí)間延長,SA+、SA-的Pro含量均達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖3),SA與E+比SA 與E-相互作用效果明顯,SA+的Pro含量比SA-分別顯著(P<0.05)高20.3%,42.9%,51.8%,47.6%和18.2%。ABA處理下,除脅迫第2天外,各時(shí)間段ABA+的Pro含量均顯著(P<0.05)高于ABA-(圖3),且分別提高了37.9%,54.7%,28.1%和26.1%。
圖3 不同激素處理下脯氨酸含量隨時(shí)間的變化Fig.3 The change of proline contents when treated with different hormones
2.3.2不同外源激素和內(nèi)生真菌互作對(duì)醉馬草幼苗SS含量的影響 隨脅迫時(shí)間的延長,醉馬草幼苗SS含量總體呈先升高后降低的趨勢(shì),且與CK比較,一定脅迫時(shí)間內(nèi),外源激素處理下幼苗SS含量高于CK。CK處理下,脅迫第6天時(shí),CK的SS含量達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖4),CK+的SS含量比CK-顯著(P<0.05)高26.5%。SA處理下,脅迫第6天和第8天時(shí),SA+的SS含量顯著(P<0.05)高于SA-(圖4),分別提高了23.7%和15.3%。ABA處理下,脅迫第6天和第8天時(shí),ABA+、ABA-的SS含量達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖4),ABA+的SS含量比ABA-分別顯著提高了9.1%和11.4%。
圖4 不同激素處理下可溶性糖含量隨時(shí)間的變化Fig.4 The change of soluble sugar contents when treated with different hormones
2.4.1不同外源激素和內(nèi)生真菌互作對(duì)醉馬草幼苗SOD活性的影響 隨脅迫時(shí)間的延長,醉馬草幼苗SOD活性總體呈先升高后降低的趨勢(shì),且與CK比較,一定脅迫時(shí)間內(nèi),外源激素處理下幼苗SOD含量高于CK。CK處理下,各脅迫時(shí)間段E+幼苗SOD活性均顯著(P<0.05) 高于E-(圖5)。SA處理下,除第0天外,隨著脅迫時(shí)間的延長,各時(shí)間段SA+、SA-的SOD活性均達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖5),SA+的SOD活性比SA-分別顯著(P<0.05)高出39.0%,62.1%,10.2%和44.8%。ABA處理下,除脅迫第4天外,其他各脅迫時(shí)間段ABA+的SOD活性均顯著(P<0.05)高于ABA-(圖5),ABA提高了E+幼苗的SOD活性,比E-分別顯著(P<0.05)提高了17.6%,53.2%,10.1%和15.0%。
圖5 不同激素處理下SOD活性隨時(shí)間的變化Fig.5 The change of SOD activity when treated with different hormones
2.4.2不同外源激素和內(nèi)生真菌互作對(duì)醉馬草幼苗POD活性的影響 隨脅迫時(shí)間的延長,醉馬草幼苗POD活性總體呈先升后降的趨勢(shì),且與CK比較,一定脅迫時(shí)間內(nèi),外源激素處理?xiàng)l件下幼苗POD活性高于CK。CK處理下,脅迫第0天和第4天時(shí)E+、E-的POD活性達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖6), E+的POD活性比E-分別顯著(P<0.05)提高了18.0%和16.2%。SA處理下,脅迫第4天和第6天時(shí),SA+、SA-的POD活性達(dá)到顯著(P<0.05)水平(圖6),SA+的POD活性比SA-分別顯著(P<0.05)高出14.6%和18.0%。ABA處理下,脅迫第0,4,6天時(shí),ABA+的POD活性顯著(P<0.05)高于ABA-(圖6),分別高出24.8%,33.0%和17.9%。
圖6 不同激素處理下POD活性隨時(shí)間的變化Fig.6 The change of POD activity when treated with different hormones
內(nèi)生真菌、激素、時(shí)間單獨(dú)作用和激素與時(shí)間、激素與內(nèi)生真菌、內(nèi)生真菌與時(shí)間及三者互作均對(duì)Pro含量和SOD活性有顯著性(P<0.05)的影響(表1)。
表1 SA(S)、ABA(A)和內(nèi)生真菌(E)在不同的時(shí)間(T)對(duì)5 ℃低溫脅迫下的醉馬草CHL、MDA、Pro、SS、SOD和POD的重復(fù)度量方差分析結(jié)果Table 1 Results of repeated measures ANOVA for the effects of chlorophyll content, MDA content, proline content, soluble sugar content, SOD activity and POD activity of A. inebrians under 5 ℃
S: SA; E: Endophyte; T: Time; A: ABA.
有研究表明Neotyphodium內(nèi)生真菌侵染可以增加葉綠素和可溶性糖的含量,從而提高宿主中華羊茅(Festucasinensis)的抗寒性[36]。楊洋[37]研究發(fā)現(xiàn),無論在實(shí)驗(yàn)室、盆栽與田間試驗(yàn),帶內(nèi)生真菌的中華羊茅SOD、POD活性高于不帶內(nèi)生真菌的中華羊茅,且?guī)в袃?nèi)生真菌的中華羊茅對(duì)可溶性糖和脯氨酸的積累能力顯著強(qiáng)于不帶菌的植株。本研究表明,在CK、SA和ABA處理下,E+幼苗Chl含量、保護(hù)性酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均高于E-幼苗,說明內(nèi)生真菌對(duì)醉馬草幼苗在低溫脅迫下起到了一定的緩解作用。MDA含量是植物細(xì)胞膜脂過氧化程度的體現(xiàn),它含量的高低可作為考察植物細(xì)胞受脅迫嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一,MDA含量越高說明植物體受損越嚴(yán)重,抗逆性越差,反之則抗逆性較強(qiáng)。在CK、SA和ABA處理下,隨著低溫脅迫時(shí)間的延長,E+、E-的MDA含量均呈升高趨勢(shì),且E+的增加程度顯著(P<0.05)低于E-,這表明E+抵抗低溫的能力高于E-。
冷害作為環(huán)境脅迫的一個(gè)重要因子,直接影響植物的生長和發(fā)育。植物幼苗長期受低溫脅迫首先會(huì)表現(xiàn)出葉片失綠和萎蔫現(xiàn)象,導(dǎo)致其生長遲緩,光合作用減弱。用ABA處理小麥(Triticumaestivum)幼苗,無論短期還是長期處理,ABA都能不同程度提高小麥幼苗的光合能力、抗氧化酶活性等指標(biāo),從而增強(qiáng)對(duì)環(huán)境脅迫的抗性[38]。在低溫脅迫時(shí),噴施一定濃度的SA可以提高香蕉(Musanana)幼苗的光合能力,從而增強(qiáng)香蕉幼苗的抗寒性[39]。本研究中,與對(duì)照相比較,SA和ABA處理下,葉綠素含量均高于CK。SA處理下,在脅迫的第6天和第8天時(shí)E+的Chl含量顯著高于(P<0.05)E-,而ABA處理下,從第2天開始就達(dá)到顯著水平,說明SA和ABA均可以提高植物的抗寒性,只是各自表達(dá)的時(shí)間不一致。主要是因?yàn)锳BA屬于激素類物質(zhì),在寒冷脅迫下,脫落酸啟動(dòng)細(xì)胞抗冷基因的表達(dá),誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗寒能力。SA是非激素類有機(jī)物質(zhì),在植物體內(nèi)通過傳導(dǎo)作用提高植物的抗逆能力[20]。植物處于冷害脅迫下,也會(huì)導(dǎo)致活性氧清除系統(tǒng)活性降低,細(xì)胞膜脂化程度降低、抗逆能力下降等一系列外部及內(nèi)部變化[12,40],施用外源激素SA和ABA可以增強(qiáng)植物的抗寒性,在多種植物上都表現(xiàn)為保護(hù)性酶活性提高、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加和MDA含量的下降[41-45]等,本試驗(yàn)對(duì)低溫下外源SA和ABA處理醉馬草抗寒性的研究也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
MDA是膜脂氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷,植物受到逆境傷害時(shí),植物體內(nèi)MDA含量會(huì)升高,導(dǎo)致植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受到傷害。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在CK、SA和ABA處理下,隨脅迫時(shí)間的延長,醉馬草幼苗MDA含量均呈上升趨勢(shì),在脅迫的第6天和第8天時(shí),E+與E-的MDA含量均達(dá)到顯著水平,且SA和ABA處理下,MDA含量顯著(P<0.05)低于CK。說明低溫處理下,隨脅迫時(shí)間的變化醉馬草幼苗細(xì)胞膜膜脂過氧化的程度越大,對(duì)植株的傷害越嚴(yán)重,而SA和ABA處理減弱膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累。此結(jié)果與魏安智等[28]和徐冬梅[31]的研究結(jié)果一致。游離脯氨酸和可溶性糖作為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),具有清除活性氧和穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用,從而起到抗寒作用[46]。本研究表明,在SA和ABA處理下,醉馬草幼苗Pro和SS含量在脅迫的不同時(shí)間段均高于CK。是因?yàn)橹参矬w內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,植物在遭受逆境脅迫時(shí)體內(nèi)脯氨酸含量會(huì)顯著增加[47]??扇苄蕴鞘侵参锟鼓孀饔弥幸粋€(gè)重要的滲透調(diào)節(jié)因子,也是植物體中重要的能源和碳源,植物遭受低溫脅迫時(shí)常常會(huì)積累大量的可溶性糖,含量越多,表明植物抗寒的能力越強(qiáng)[48]。本研究結(jié)果表明,SA和ABA處理后進(jìn)一步提高了低溫脅迫下醉馬草體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro的含量和SS的積累。此結(jié)果與李冬花[44]研究外源ABA和SA對(duì)低溫脅迫下圓柏屬植物幼苗生理特性時(shí)也得到了類似的結(jié)果?;钚匝醴e累是引起質(zhì)膜受損的重要原因,而低溫脅迫能造成細(xì)胞內(nèi)活性氧積累。提高抗氧化酶活性與抗氧化劑含量,清除積累的活性氧是提高植物抗寒性的主要途徑之一[25]。SOD是植物細(xì)胞內(nèi)的一類重要保護(hù)酶,可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,是活性氧清除劑之一,能將超氧化物陰離子自由基快速氧化為 H2O 和 O2,保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受到傷害; POD 合成以清除活性氧自由基的積累,這是細(xì)胞酶保護(hù)系統(tǒng)的一種應(yīng)激機(jī)制[21]。在本研究結(jié)果中,除脅迫當(dāng)天,與對(duì)照相比,噴施外源激素的醉馬草幼苗無論是E+還是E-的SOD和POD活性均顯著高于(P<0.05)對(duì)照處理,說明SA和ABA處理減弱了低溫脅迫對(duì)SOD和POD活性的影響,降低了自由基的傷害,從而增加了抗寒能力。此結(jié)果與李兆亮等[45]和李雪梅等[38]的研究結(jié)果一致。但隨著脅迫時(shí)間的持續(xù),SOD和POD活性降低,幼苗受到的傷害越嚴(yán)重,是因?yàn)镾OD和POD則是冷害敏感型,這種酶合成的啟動(dòng)時(shí)間較早,在受害初期就已經(jīng)大量合成,這也是植物自身膜保護(hù)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制。此結(jié)果與劉海卿等[41]的在對(duì)不同葉齡期葉面噴施ABA對(duì)北方白菜型冬油菜抗寒性的研究中已得到證實(shí)。
在SA和ABA處理下,SA+和ABA+的Chl和SS含量始終大于CK+,SA+和ABA+的MDA含量始終小于CK+,在脅迫的第4,6,8天時(shí),SA+和ABA+的Pro含量、SOD和POD的活性大于CK+,而在不同脅迫時(shí)間段,均有SA-和ABA-的Chl含量、Pro含量、SOD和POD的活性小于CK-。說明ABA和SA與內(nèi)生真菌互作對(duì)低溫脅迫下醉馬草幼苗的生長起到了保護(hù)作用。
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