細胞內的氧化還原感受器蛋白與氧化還原信號轉導*

魏亞萍， 王 媛， 郭曉筍△， 蔣 凡,3△

(山東大學 1基礎醫(yī)學院生理與病理生理學系， 2齊魯醫(yī)院急診科， 3教育部和國家衛(wèi)計委心血管重構和功能研究重點實驗室， 山東 濟南 250012)

1 背景

氧化還原反應是哺乳動物細胞存活所必需的，在細胞內的生化反應及代謝過程中氧化與還原占據著重要的位置。細胞內環(huán)境中氧化還原狀態(tài)的輕微改變可能對細胞的生物活性產生重大影響。理論上，細胞內氧化還原狀態(tài)的改變必須通過測定不同氧化還原電子對的還原電位來定量[1-2]。但在實際的生物學研究當中，人們所說的氧化還原狀態(tài)通常是指胞內或細胞周邊活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的相對高低?；钚匝醯拇罅慨a生可能對細胞造成氧化損傷，即我們通常所說的“氧化應激(oxidative stress)”狀態(tài)。目前大量研究顯示，氧化應激與心血管系統疾病、神經退行性疾病、糖脂代謝疾病，以及衰老的過程密切相關。但是值得我們關注的是，在研究疾病發(fā)生機制的過程中，我們不應該簡單地把ROS產生增加等同于氧化應激損傷。實際上，細胞內存在多種對氧化還原狀態(tài)敏感的蛋白，氧化還原狀態(tài)的改變可以影響這些蛋白的功能，并對其下游的信號通路產生調控作用。因此我們可以認為這些蛋白分子是細胞內氧化還原狀態(tài)的感受器(redox sensor)。這些氧化還原感受器能夠被ROS激活，而且在很多情況下這些氧化還原敏感的信號蛋白能夠介導細胞的保護作用，提高細胞的應激耐受水平。因此，深入挖掘ROS產生背后是否還隱藏有更復雜、更具特異性的信號轉導通路，可能為發(fā)現疾病發(fā)生發(fā)展過程中新的調控機制提供線索。

我們考察一個蛋白分子是否有氧化還原感受器的功能時，首先需要區(qū)分這個蛋白是否能夠直接對氧化還原起反應，即其功能是能夠被蛋白本身氧化還原修飾所調控，還是其活性的改變是否通過其它傳感器分子間接為ROS所影響。其次，我們還需要區(qū)分這個蛋白分子能否對細胞內源性產生的ROS分子(如細胞內NADPH氧化酶或線粒體產生的ROS)產生應答，還是僅僅能夠被大量外源性的ROS(即嚴重的氧化應激狀態(tài))非特異性地損傷或滅活。大約30年前，研究者發(fā)現哺乳動物細胞可以自主產生ROS，并借助這些ROS分子調控細胞功能[3]。在此之后，人們觀察到在原核細胞中，有些轉錄因子可通過直接感知ROS分子(如超氧陰離子及過氧化氫)的存在來調節(jié)其與DNA的結合活性，從而調控某些基因的表達[4]，這些基因的產物通常是具有抗氧化保護作用的分子。之后，人們進一步發(fā)現在哺乳動物細胞中也存在類似現象[5]?；诖?，人們提出了“氧化還原信號轉導(redox signaling transduction)”的概念，即細胞可以借助ROS[包括一氧化氮(nitric oxide,NO)分子]進行細胞內或細胞間的信息傳遞[6]。

2 氧化還原敏感的轉錄因子

目前已知的蛋白分子氧化還原感知能力的主要分子機制是通過ROS(氧化)或NO(S-亞硝基化)所介導的巰基基團(主要是半胱氨酸殘基)的氧化還原修飾而實現的[7-8],見圖1。激活蛋白 1(activator protein 1，AP-1)是由c-Fos和c-Jun蛋白組成的異源二聚體，它作為一種典型的具有氧化還原感知功能的轉錄因子，是人們最早發(fā)現的氧化還原感受器之一[9]。在Fos與Jun的DNA結合區(qū)域均含有高度保守的半胱氨酸，對氧化還原調控顯現敏感性[5];該半胱氨酸的氧化可抑制AP-1的DNA結合活性，巰基抗氧化劑可逆轉這種作用。之后有研究證實，哺乳動物表達的熱休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)可直接感知氧化還原變化。過氧化氫可刺激HSF1組裝成同源三聚體，其組裝依賴于HSF1 DNA結合結構域的2個半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸參與對氧化還原反應敏感的二硫鍵的形成[10]。HSF1突變體(1個或2個半胱氨酸被替換)不能形成ROS誘導的三聚體，其DNA結合功能受損。最近的一項研究表明，Ets家族的轉錄因子(如Etv1、Etv4和Etv5)可通過二硫鍵形成同源二聚體，與單體相比，Ets二聚體的DNA結合能力顯著降低，表明氧化還原依賴的調控機制可能會影響這些Ets轉錄因子的活性[11]。Etv蛋白與腫瘤發(fā)生密切相關，因此氧化還原依賴的二聚體形成可能參與Etv蛋白介導的腫瘤細胞對微環(huán)境的應答反應。以上實例提示ROS(特別是過氧化氫)介導的分子內或分子間半胱氨酸巰基氧化可以直接調控多種轉錄因子的活性，這一機制可以解釋很多對氧化還原敏感的細胞學效應。值得注意的是，研究發(fā)現，越來越多的轉錄因子具有氧化還原感受器的功能，提示這可能是細胞內一個非常重要的轉錄調控機制。

Figure 1. Different types of redox modification of cysteine (Cys). A: oxidative modifications. The initial cysteine oxidation reaction is reversible. However, when oxidative stress persists, the oxidation reactions become irreversible. B:S-nitrosylation. C:S-glutathionylation. Trx: thioredoxin; Grx: glutaredoxin; GSNOR:S-nitrosoglutathione reductase; GSH: glutathione.

圖1不同形式的半胱氨酸氧化還原修飾

3 氧化還原敏感的核受體

Rev-erbβ是一種新發(fā)現的能感知氧化還原狀態(tài)的轉錄因子，其本身是能與血紅素結合的核激素受體[12]。Rev-erbβ分子中的巰基二硫鍵氧化還原開關可調控其配體結合結構域與血紅素的相互作用，其中還原型Rev-erbβ的結合能力是氧化型的5倍。此外，Okamoto等[13]報道肌肉特異性轉錄因子——肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)會發(fā)生NO誘導的亞硝基化作用，破壞MEF2與DNA結合及其轉錄活性，具體過程為：MEF2形成二聚體后形成一個分子口袋結構，可促進DNA結合結構域中保守半胱氨酸的S-亞硝基化。這種氧化還原改變可抑制神經發(fā)生和神經元存活，可能是NO參與神經退行性疾病的一個重要分子機制[13]。

4 氧化還原敏感的轉錄輔助調節(jié)因子

細胞中有多種轉錄因子還可以通過與氧化還原敏感的調控因子結合來間接感知氧化還原變化，這一機制在氧化還原依賴的轉錄調控方面也發(fā)揮重要作用。例如，氧化還原敏感的多功能蛋白APE1/Ref-1是多個轉錄因子的調控因子，包括AP-1、核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)、p53、激活轉錄因子/cAMP反應元件結合蛋白(activating transcription factor/cyclic AMP response element binding protein，ATF/CREB)及低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α)等[14]。通常情況下，ROS引起的氧化反應可以使這些轉錄因子的DNA結合活性降低，而Ref-1可以使這些轉錄因子還原，并提高其轉錄活性[14]。但是，Ref-1的效應似乎不具特異性，因此很難將這些作用歸結為一條特異的信號傳導通路。

在通過氧化還原敏感的輔助因子特異性地調節(jié)轉錄因子的功能中，最具代表性的例子可能是Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)系統[15]。Keap1為富含半胱氨酸的蛋白質，其分子中的3個半胱氨酸(第151、273和288位)在氧化還原依賴的Keap1構象改變中發(fā)揮重要作用[14, 16]。Keap1與Nrf2結合可促進Nrf2蛋白泛素化及快速降解；而Keap1經氧化后與Nrf2解離，使得Nrf2在核內累積，促進多種具有抗氧化和細胞保護功能的酶類表達[16]。Keap1能對外源性氧化應激產生應答，同時對NADPH氧化酶產生的細胞內源性ROS也能產生應答[17]。

另一項研究表明，信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)亦可被氧化還原所調控，其調控機制與過氧化物氧還蛋白2(peroxiredoxin-2)有關[18]。Peroxiredoxin是細胞內廣泛存在的、能與過氧化氫起反應的抗氧化活性蛋白。在過氧化氫作用下，peroxiredoxin-2可與STAT3形成二硫化中間體，進而催化STAT3分子間二硫鍵形成，形成STAT3寡聚體，降低STAT3的轉錄活性。STAT3的氧化是可逆的，可被細胞內的硫氧還蛋白(thioredoxin)還原[18]。

5 氧化還原敏感的酪氨酸激酶及酪氨酸磷酸酶

Smith等[19]證實,基于半胱氨酸的氧化還原“開關”還存在于非受體酪氨酸激酶Janus kinase 2 (JAK2)中，并可調節(jié)JAK2的催化活性。JAK2為轉錄因子STAT的上游激酶，該通路參與調控細胞增殖、存活及髓系造血功能。研究表明，JAK2的2個半胱氨酸(866與917)可共同發(fā)揮氧化還原敏感的“開關”作用，使得JAK2的催化活性直接受細胞氧化還原狀態(tài)的調控。將JAK2中這2個半胱氨酸突變?yōu)楸彼岷?，則JAK2對氧化還原不再敏感[19]。

目前研究最為深入的氧化還原敏感的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)是PTP1B。位于PTP1B活性結構域第215位的半胱氨酸殘基(Cys215)是其催化活性所必需的，其它PTPs家族成員也由相似的半胱氨酸殘基決定其活性[20]。PTP1B依靠巰基陰離子基團對底物進行親核反應，但巰基陰離子對氧化作用十分敏感，例如半胱氨酸殘基可被胞內產生的過氧化氫氧化。自由巰基被氧化形成次磺酸，繼而與相鄰的Ser216殘基反應形成磺胺，因此細胞中的ROS可以使PTP1B失活[20]。PTP1B的底物非常多樣，包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor)、胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor)、集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor 1 receptor)、c-Src以及黏著斑激酶(focal adhesion kinase)等等[21]，因此可以預測ROS能夠通過調節(jié)PTP1B的活性影響多種細胞功能。

6 絲/蘇氨酸蛋白激酶和磷酸酶

共濟失調毛細血管擴張癥突變型(the ataxia-telangiectasia mutated，ATM) 激酶是細胞DNA損傷反應通路中一個重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶。傳統的ATM激酶激活時可刺激DNA的雙鏈損傷。然而最近的研究發(fā)現，ROS對ATM激酶有直接激活作用，且這種作用不依賴于DNA損傷及ATM上游的激活物MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) 復合體[22]。H2O2可以直接氧化ATM激酶，進而形成具有功能活性的二聚體。在ATM激酶氧化-活化過程中，位于ATM激酶分子C端的第2 991位半胱氨酸具有決定性作用。將C2991突變?yōu)榱涟彼岷螅珹TM激酶失去對H2O2的反應性，而對DNA損傷和MRN 復合體的反應性不受影響[22]。目前有證據顯示ATM激酶的氧化還原調控可能在代謝性疾病中發(fā)揮重要作用。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族在控制細胞增殖、遷移、存活、分化及炎癥反應等諸多生物功能方面占據重要的中心位置。MAPK的功能受MAPK磷酸酶(MAPK phosphatase，MKP)的負向調控。其中MKP-1是一個具有酪氨酸/絲蘇氨酸磷酸酶雙重活性的酶，能夠拮抗p38和ERK1/2的功能。與酪氨酸磷酸酶類似，MKP的活性中心也存在關鍵的半胱氨酸殘基。Kim等[23]的研究發(fā)現，MKP-1分子中第258位半胱氨酸可以在有ROS或NO，以及谷胱甘肽存在的情況下，發(fā)生S-谷胱甘肽化(S-glutathionylation),見圖1C，即蛋白質的反應性巰基與氧化的谷胱甘肽之間形成二硫鍵。MKP-1的S-谷胱甘肽化抑制了其磷酸酶活性，并促進MKP-1經蛋白酶體途徑的降解。該研究還證實細胞內源性NOX4型NADPH氧化酶所產生的 H2O2能夠通過這個途徑調控MKP-1的功能及細胞的炎癥反應[23]

7 氧化還原敏感的離子通道

越來越多的研究結果顯示，細胞中多種離子通道蛋白具有氧化還原感受器的功能[24]。例如，鈣庫操縱性鈣內流通道的主要組成成分之一——基質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)[25]就具有直接的氧化還原感受功能，這種功能依賴于其內質網腔面的一個半胱氨酸C56。在氧化應激情況下，C56發(fā)生S-谷胱甘肽化，并顯示出鈣庫非依賴性的鈣通道活性增強[26]。同時，鈣庫操縱性鈣通道的另一個主要組成部分Orai1蛋白[25]也具有氧化還原敏感性。Orai1分子中的活性半胱氨酸 C195 能夠對H2O2發(fā)生反應并抑制Orai1介導的鈣內流[26]。從以上結果可以看出，目前對氧化還原狀態(tài)如何精確調控鈣庫操縱性鈣內流還沒有形成統一認識。 另外一個氧化還原敏感的離子通道的實例是腺苷受體P2X。P2X受體是非選擇性的陽離子門控通道。研究發(fā)現P2X2受體的功能受ROS調控，其分子中的第430位半胱氨酸氧化后會導致P2X2受體的功能上調[27]。然而目前的證據也提示不同亞型的P2X受體對ROS的反應性(功能上調或下調)可能存在明顯差異[27]。 除鈣庫操縱性鈣通道和P2X受體外，其它類型離子通道的某些成員，包括線粒體鈣單向轉運體(mitochondrial Ca2+uniporter)、瞬時受體電位通道(transient receptor potential channels)、電壓門控鈣通道(voltage-gated Ca2+channels)、電壓門控鉀通道(voltage-gated K+channels)以及ryanodine receptor鈣通道等，均被證實具有氧化還原感知功能。目前所有這些研究結果提示，氧化還原引起的半胱氨酸修飾可能是ROS調控這些離子通道共同的分子機制[24]。

8 氧化還原調節(jié)細胞骨架蛋白

除了以上提到的這些信號分子能夠感受細胞內氧化還原狀態(tài)的改變，并介導相應的氧化還原信號轉導功能外，越來越多的研究還發(fā)現，細胞內的結構蛋白和骨架蛋白亦有氧化還原感受器的功能。例如，人們發(fā)現在肌動蛋白(actin)、肌動蛋白結合蛋白及肌動蛋白調節(jié)蛋白的分子中均含有氧化還原反應性的半胱氨酸殘基以及蛋氨酸殘基位點。ROS能夠通過改變這些位點的氧化還原狀態(tài)調節(jié)細胞骨架的結構功能，進而對細胞的遷移、增殖及形態(tài)變化產生重要影響[28]。目前已知α-肌動蛋白中的5個半胱氨酸殘基及β-肌動蛋白中的6個半胱氨酸殘基都可以發(fā)生氧化，而新近研究顯示，生理條件下較低濃度的ROS可以促進肌動蛋白的聚合以及細胞內張力纖維的形成[28]。除細胞骨架蛋白外，人們還發(fā)現某些結構蛋白也顯現氧化還原敏感性。閉合蛋白(occludin)是細胞間形成緊密連接重要的結構蛋白。Walter等[29]的研究顯示，occludin蛋白胞內C末端的第408位半胱氨酸在介導occludin二聚體形成過程中具有決定作用，而該半胱氨酸殘基是受氧化還原調控的。

9 結束語

綜上所述，目前人們已經發(fā)現哺乳動物細胞內存在多種具有氧化還原感知功能的蛋白，包括轉錄因子、蛋白激酶、磷酸酶、離子通道以及細胞結構蛋白等。目前，我們還不清楚為何細胞內含有如此多的氧化還原感受器。為此，我們提出兩種假說。第一，這種現象可能反映了氧化應激損傷對哺乳動物細胞影響的重要性，為了克服氧化應激的損傷作用，細胞需要一個信號網絡，而不是單一獨立的信號通路，及時對ROS作出反應以維持細胞內穩(wěn)態(tài)；第二，從進化的角度來說，氧化還原信號轉導機制可能已演變?yōu)橐环N通用的細胞內警報系統[30-31]。我們回顧文獻發(fā)現，自然界中為數眾多的、相互沒有關聯的應激刺激都能使細胞內ROS產生增加，進而通過氧化還原機制調控細胞內信號傳導過程。此時ROS分子可以被認為起動了一種類似預適應(preconditioning)過程的反應，氧化還原信號轉導通路可以將初始的刺激信號進行整合放大，提高細胞對應激的耐受性，因而對后續(xù)的應激刺激產生抗性[30-31]。如果刺激過強，ROS產生過多，則氧化還原信號轉導通路可觸發(fā)細胞的凋亡過程。我們預測還有很多的氧化還原傳感器樣的蛋白分子尚未被發(fā)現，而我們對細胞內氧化還原信號轉導網絡的整體認識尚很不全面。目前現有的證據充分說明我們不能把細胞內ROS產生增加簡單地等同于氧化應激損傷，而忽略其背后是否還有更復雜的生物學機制。

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