利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-196b在結(jié)直腸癌患者中的臨床表達特征并探索miR-196b的體外抗5-FU作用*

車 佳， 黃蘭蘭， 婁 瓊， 楊湘玲△， 劉煥亮△

(中山大學附屬第六醫(yī)院 1廣東省胃腸病學研究所， 2檢驗科， 廣東 廣州 510655)

結(jié)直腸癌(clolrectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一[1-2]。2016年的中國癌癥報告表明，2012年結(jié)直腸癌患者新增人數(shù)達33萬，占惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的9.24%，居第4位，死亡人數(shù)達16萬[3]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長度約為21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，具有高度保守的特性，不直接參與編碼蛋白質(zhì)，但卻可以與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’UTR)結(jié)合，通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達進而發(fā)揮重要作用[4]。miR-196家族包括miR-196a-1、miR-196a-2和miR-196b，其中， miR-196a-1和miR-196a-2參與多種實體瘤的發(fā)生和進展，如乳腺癌[5]、骨肉瘤[6]、結(jié)直腸癌[7]、口腔癌[8]、惡性膠質(zhì)瘤[9]及胃癌[10]； miR-196b位于第7號染色體上(7p15.2)，處于HOXA9和HOXA10基因之間進化高度保守的區(qū)域內(nèi)[11]。為探索miR-196b在結(jié)直腸癌患者中的表達水平和臨床意義以及其與CRC臨床一線用藥5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)敏感性的關系，我們在癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中下載結(jié)直腸癌miRNA測序數(shù)據(jù)及其對應的臨床病理資料，運用SPSS 17.0分析miR-196b在結(jié)直腸癌患者中的表達水平及相對應的臨床特征。 同時采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法在結(jié)直腸癌細胞株HCT116中過表達miR-196b，探索過表達miR-196b的HCT116細胞對5-FU敏感性的變化，為下一步研究miR-196b在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機制奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人源結(jié)直腸癌細胞株HCT116來自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection， ATCC)。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清 (Gibco)；Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR?Kit和SYBR?Premix Ex TaqTMII (TaKaRa)；miR-196b mimics和miRNA NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；5-FU(Sigma)。 Bio-Rad T100TMPCR儀(Thermal Cycler)；System Light Cycler?96熒光定量PCR 儀(Roche)；全波長多功能酶標儀(Thermo)。

2 方法

2.1采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法建立過表達miR-196b的HCT116細胞并測定轉(zhuǎn)染效率 取對數(shù)生長期的細胞，按照常規(guī)方法對細胞進行消化、傳代和計數(shù)，按每孔2.5×105細胞接種至6孔板，加入2 mL完全培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。第2天取出6孔板，在顯微鏡下確認細胞貼壁生長后，棄去培養(yǎng)基，先更換成1.5 mL沒有加入抗生素的培養(yǎng)基，分別取20 mmol/L的miR-196b mimics和miRNA NC 5 ～10 μL，加入到125 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中；同時，另取125 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基加入一只新的離心管，稀釋3.75 μL Lipofectamine 3000，輕吹混勻。將以上配好的2種試劑混合，輕吹混勻，在室溫條件下靜置5～10 min， 把上面形成的脂質(zhì)體混合物加入6孔板，輕輕搖晃并置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。關于轉(zhuǎn)染效率的測定，我們采用以上方法把帶有熒光基團FAM標記的miR-196b mimics和 miRNA NC轉(zhuǎn)染至HCT116細胞中，在轉(zhuǎn)染后的6 h和12 h，取出培養(yǎng)皿至熒光顯微鏡下用高倍鏡觀察，隨機選取視野進行拍照計數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率。

2.2過表達 miR-196b的細胞總RNA的提取 將培養(yǎng)皿取出置于超凈臺，棄去培養(yǎng)基，再用PBS洗1次，加入1 mL TRIzol試劑， 于室溫放置3～5 min后轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中。每支離心管加入200 μL氯仿，充分振蕩混合后，室溫放置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將約400 μL上層清液轉(zhuǎn)移入新的離心管中，加入等量的異丙醇，輕柔混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。小心去上清，保留離心管底部的白色團塊，用DEPC處理水配制的75%乙醇洗滌。4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清。室溫自然風干，待白色團塊變?yōu)闊o色透明后，用DEPC處理水溶解， NanoDrop測RNA濃度。

2.3采用real-time PCR檢測miR-196b的表達 本實驗使用加尾法檢測 miR-196b的表達水平，其中5’ 端引物為5’-AGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-3’，mRQ 3’ 端引物及U6引物為該公司商業(yè)引物。按照Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit的說明配制10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應體系：mRQ Buffer(2×) 5 μL、RNA sample (0.25～8 μg) 3.75 μL和mRQ Enzyme 1.25 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應條件為37 ℃ 1 h， 85 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用ddH2O按照1∶10稀釋。miR-196b的熒光定量PCR反應體系為： ddH2O 9.5 μL、SYBR Advantage Premix (2×) 12.5 μL、miRNA-specific primer (10 μmol/L) 0.5 μL、mRQ 3’ primer 0.5 μL和cDNA 2.0 μL；反應條件為 95 ℃ 預變性30 s，95 ℃ 變性5 s， 60 ℃ 退火30 s。U6反應體系為ddH2O 9.5 μL、SYBR Advantage Premix (2×) 12.5 μL、U6 forward primer (10 μmol/L) 0.5 μL、U6 reverse primer (10 μmol/L) 0.5 μL和cDNA 2.0 μL，反應條件同miR-196b。以U6為內(nèi)參照，NC組為對照組，miR-196b組為實驗組，計算基因差異表達的倍數(shù)，計算公式為2-ΔΔCt，其中ΔCt = Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因， ΔΔCt = ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

2.4采用MTS法檢測細胞對5-FU的敏感性 分別取轉(zhuǎn)染miR-196b mimics和miRNA NC的細胞，按照常規(guī)方法對細胞進行消化、傳代和計數(shù)，調(diào)整細胞密度，每孔2×103接種到96孔板中，培養(yǎng)細胞過夜。次日，按照需要把5-FU用培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度梯度，每個濃度做3個復孔，滴加于接種有細胞的96孔板里。在培養(yǎng)箱里放置72 h后，每孔加入10 μL WST-1，37 ℃靜置10～30 min，待完全溶解后，用全波長多功能酶標儀在波長為450nm處測定樣品的吸光度(A)值，進一步計算細胞存活率。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)處理統(tǒng)一使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。運用 Shapiro-Wilk法檢測miR-196b表達水平的分布情況，如果符合正態(tài)分布，采用參數(shù)檢驗方法分析miR-196b表達水平和結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關系；如果不符合正態(tài)分布，則運用Wilcoxon秩和檢驗(二分類變量)。使用中位數(shù)作為miR-196b表達水平高低的分界值。采用Kaplan-Meier法建立miR-196b的生存曲線，Log-rank檢驗比較miR-196b表達水平不同的患者生存曲線的差異及意義；采用COX回歸法分析miR-196b與其它臨床參數(shù)對結(jié)直腸癌患者預后的影響；采用卡方檢驗分析miR-196b的表達水平和其它臨床參數(shù)的相互關系；采用單因素方差分析過表達miR-196b的HCT116細胞在不同5-FU濃度下細胞存活率的統(tǒng)計學差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 miR-196b在結(jié)直腸癌患者中的表達與臨床特征的相關性

利用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對miR-196b在結(jié)直腸癌患者中的表達情況進行分析，結(jié)果顯示， miR-196b的表達水平與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.045)、 TNM分期(P=0.043)及結(jié)腸癌的局部浸潤相關(P=0.028)，見表1、 2。

用Shapiro-Wilk法檢測直腸癌患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1+N2)和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)兩組患者miR-196b表達水平的分布情況，結(jié)果顯示不符合正態(tài)分布，故采用Wilcoxon秩和檢驗對兩個獨立樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-196b的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P=0.020)，N1+N2期miR-196b的表達水平高于N0期，即miR-196b在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達量升高，見圖1。在直腸癌患者的TNM分期中，我們發(fā)現(xiàn)I+II期和III+IV期患者間miR-196b表達水平的差異也有統(tǒng)計學意義，III+IV期的直腸癌患者miR-196b的表達水平高于I+II期患者(P=0.018)，見圖2。

表1miR-196b在直腸癌中的臨床表達特征

Table 1. Clinical characteristics of miR-196b in 158 rectal cancer patients

FactorsnmiR-196bexpressionLowHighPAge(year)0.299 <604821(43.8%)27(56.2%) ≥6011058(52.7%)52(47.3%)Sex0.523 Female7234(47.2%)38(52.8%) Male8645(52.3%)41(47.7%)TNMstage0.043 I+II7644(57.9%)32(42.1%) III+IV7732(41.6%)45(58.4%)T0.816 T1+T23718(48.6%)19(51.4%) T3+T412061(50.8%)59(49.2%)N0.045 N07946(58.2%)33(41.8%) N1+N27632(42.1%)44(57.9%)M0.644 M011961(51.3%)58(48.7%) M12313(56.5%)10(43.5%)

表2miR-196b在結(jié)腸癌中的臨床表達特征

Table 2. Clinical characteristics of miR-196b in 407 colon cancer patients

FactorsnmiR-196bexpressionLowHighPAge(year)0.015 <6011870(59.3%)48(40.7%) ≥60289133(46.0%)156(54.0%)Sex0.587 Female19198(51.3%)93(48.7%) Male216105(48.6%)111(51.4%)TNMstage0.297 I+II226107(47.3%)119(52.7%) III+IV17190(52.6%)81(47.4%)T0.028 T1+T28031(38.8%)49(61.3%) T3+T4326171(52.5%)155(47.5%)N0.190 N0239113(47.3%)77(32.2%) N1+N216790(53.9%)77(46.1%)M0.681 M0306144(47.1%)162(52.9%) M15829(50.0%)29(50.0%)

Figure 1. The correlation between miR-196b expression and lymph node metastasis. Median (interquartile range).*P<0.05vsN0 group.

圖1miR-196b在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系

2 miR-196b在結(jié)直腸癌患者中的表達與生存狀況的關系

在SPSS 17.0中運用COX 回歸法分析患者的臨床信息即年齡、性別、TNM分期以及miR-196b的表達水平是否是患者生存狀況的影響因素。對于直腸癌患者，TNM分期中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.010)和遠處轉(zhuǎn)移(P=0.017)是患者生存狀況的影響因素，而miR-196b的表達與患者生存無關，見表3。對miR-196b的表達水平以中位值進行高低分組后，運用Kaplan-Meier法對2組直腸癌患者的生存曲線進行比較，發(fā)現(xiàn)高表達組和低表達組的生存曲線差異無統(tǒng)計學意義(P=0.966)，見圖3。

Figure 2. The correlation between miR-196b expression and TNM stage.Median (interquartile range).*P<0.05vsstage I+II group.

圖2miR-196b在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與TNM分期的關系

表3 影響158例直腸癌患者生存狀況的危險因素分析

HR: hazard ratio; CI: confidence interval.

Figure 3. Kaplan-Meier survival analysis in 158 CRC patients.

圖3miR-196b的表達水平與結(jié)直腸癌患者的生存關系

3 過表達miR-196b

為研究miR-196b在結(jié)直腸癌細胞中的生物學功能，我們在結(jié)直腸癌細胞株HCT116中分別瞬時轉(zhuǎn)染miR-196b mimics和miRNA NC，和對照組相比，過表達組的miR-196b表達水平明顯升高，表明過表達成功，見圖4。

4 miR-196b促進結(jié)直腸癌細胞對5-FU的抗藥性

為了檢測miR-196b在結(jié)直腸癌細胞中對5-FU作用的影響，我們進行了藥物敏感性實驗。對轉(zhuǎn)染了miR-196b mimics和miRNA NC的HCT 116細胞進行梯度濃度5-FU處理，培養(yǎng)72 h后，利用MTS檢測細胞的存活率，可見過表達miR-196b的細胞存活率明顯高于對照組(P<0.05)，表明過表達miR-196b的細胞具有更強的抗藥性，見圖5。

Figure 4. Overexpression of miR-196b in HCT116 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group.

圖4在HCT116細胞中過表達miR-196b

Figure 5. Overexpression of miR-196b increased 5-FU resistance of CRC cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖5過表達miR-196b促進結(jié)直腸癌細胞對5-FU的耐藥性

討 論

miRNA廣泛參與調(diào)節(jié)各種生理或病理過程，其在腫瘤中異常表達，可參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各個階段，如凋亡、增殖、細胞分化及轉(zhuǎn)移等[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)， miR-21、miR-19a、miR-422a和miR-499等是結(jié)直腸癌復發(fā)與轉(zhuǎn)移的潛在標志物[13-14]。為探索miR-196b是否可以作為結(jié)直腸癌新的分子生物標志物，我們在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載結(jié)直腸癌miRNA測序數(shù)據(jù)及其對應的臨床病理資料，研究miR-196b在結(jié)直腸癌患者中的表達水平和臨床意義以及其與臨床一線用藥5-FU的敏感性的關系。

TCGA計劃是由美國國立衛(wèi)生研究院組織美國國立癌癥研究所和國立人類基因組研究所于2006年啟動的大型研究，旨在全面系統(tǒng)性地了解惡性腫瘤的形成、生長和轉(zhuǎn)移的生物學基礎和病理機制相關的基因組變化，以促進癌癥的早期診斷，加快治療癌癥的步伐，并進一步預防癌癥。TCGA 計劃的大部分數(shù)據(jù)和研究結(jié)果都公開在其網(wǎng)站上，可以免費下載。迄今為止，已有多篇論文在國際知名期刊上發(fā)表[15-16]。我們在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載結(jié)直腸癌的miRNA測序數(shù)據(jù)及其對應的臨床病理資料后分析發(fā)現(xiàn)，158例直腸癌患者miR-196b的表達水平與TNM分期有顯著的相關性，再進一步細化分期時，即對T、N和M三個分期分別來討論分析時發(fā)現(xiàn)， miR-196b與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-196b的表達水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。2013年， 蘭鴻波等[17]收集了30例結(jié)直腸癌患者手術(shù)后結(jié)直腸癌組織及其對應的正常黏膜組織，運用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測 miR-196b 的表達水平，結(jié)果顯示miR-196b的表達與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及遠處轉(zhuǎn)移均有關，而與腫瘤部位、大小、大體類型、浸潤深度、組織分化程度、患者的年齡及性別無關， 與我們的分析結(jié)果相一致。綜上所述，我們推測miR-196b與結(jié)直腸癌的侵襲和遷移能力相關，然而其具體的作用機制還需要進一步探索。

在生存分析中， miR-196b不是結(jié)直腸癌患者的獨立預后因子，這一點與已有的研究相似，有研究發(fā)現(xiàn)， miR-196b與miR-196a共同作為消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子標記物，兩者表達水平呈正相關關系，預測生存結(jié)局的特異性和靈敏度都比任何單獨一個要高得多[5, 7]。這種多個基因協(xié)同發(fā)揮致癌或抑癌作用的機制并不罕見，很多功能有相似性的基因相輔相成，Li等[18]報道在肺癌的研究中建立一個由8種miRNAs(含有miR-196b)聯(lián)合預測模型，該預測模型能夠很好地預測肺腺癌患者的預后。據(jù)此，我們推測miR-196b可能與多個miRNA協(xié)同參與結(jié)直腸癌的進展。

研究顯示， miRNA可參與影響結(jié)直腸癌患者對化療藥物的敏感性，與患者的化療應答密切相關[19]。 因此我們也探討了miR-196b對結(jié)直腸癌的5-FU敏感性的影響。 結(jié)果顯示， 過表達miR-196b可降低結(jié)直腸癌細胞對5-FU的敏感性，表明miR-196b可能與結(jié)直腸癌的化療耐藥相關。Svoboda等[19]在2012年的研究中發(fā)現(xiàn)miR-196b的表達與胸苷合成酶(thymidylate synthetase，TS)抑制劑的化療抵抗性之間存在著潛在的聯(lián)系。TS是胸腺嘧啶在合成過程中非常重要的酶，又是5-FU作為抗腫瘤代謝藥物在發(fā)揮作用時的關鍵酶，這說明miR-196b可能與5-FU代謝相關的酶之間存在著潛在的關系，而miR-196b是如何參與到5-FU的代謝途徑中、miR-196b的表達跟5-FU相關的代謝酶之間存在著什么樣的關系還需要我們進一步探索。

本研究運用現(xiàn)有的 TCGA 數(shù)據(jù)庫，通過分析腫瘤基因組信息了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機理，進一步發(fā)現(xiàn)腫瘤標志物和藥物作用基因靶點，可為癌癥的精準診斷和治療提供支撐。在miRNA水平對結(jié)直腸癌相關的測序數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù)進行了挖掘，發(fā)現(xiàn)miR-196b可能和結(jié)直腸癌的侵襲和遷移有關，并與5-FU的化療敏感性相關，對今后miR-196b參與結(jié)直腸癌的分子機制及預后研究有一定的理論指導意義。

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