人參皂苷RH2對MCAO大鼠血管新生的調(diào)節(jié)

謝 靖， 梁華峰， 祁 鳴， 高惠春， 鄭 璽

(1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 石河子 832008； 2新疆阜康市人民醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 阜康 831500； 3解放軍第四七四醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 烏魯木齊 830000)

在人口老齡化趨勢愈加明顯的今天，腦血管疾病的患病率也呈現(xiàn)上升趨勢，其中， 腦卒中致死已成為我國居民第一死因，且其致殘率和復發(fā)率一直高居不下[1]。腦組織缺血損傷后機體自身可代償性啟動血管生成反應，建立側支循環(huán)以改善缺血區(qū)周圍的血流供應，為修復神經(jīng)損傷提供良好的微環(huán)境[2-4]，故如何促進缺血后腦組織的血管新生已成為腦卒中后期康復治療的新靶點。隨著中醫(yī)藥科學的發(fā)展，近年來關于中藥和針灸等干預手段治療缺血后血管新生的研究已得到廣泛的關注，應用前景十分廣闊。

人參皂苷RH2(ginsenoside RH2，GS-RH2)是由紅參中提取出的稀有單體皂苷，歸屬于達瑪烷(dammarane)原人參二醇型皂苷(protopanaxadiol saponins, PDS)，是人參中主要的活性成分之一[5]，其藥理活性范圍非常廣泛。研究顯示， 人參皂苷RH2不僅可通過多種機制抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]，單獨使用時還可有效增強人體的免疫功能。此外，有實驗證明PDS可通過降低大鼠血清總膽固醇并提高血清一氧化氮(nitric oxide, NO)水平來發(fā)揮保護血管內(nèi)皮和抗動脈粥樣硬化的作用[9]。但是， 人參皂苷RH2在缺血性腦損傷中的作用并不明確，本研究擬通過構建大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，研究人參皂苷RH2對缺血性腦損傷后血管新生的作用及相關作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、材料與試劑

健康雄性SD大鼠58只，體質量260～280 g，購自石河子大學醫(yī)學院實驗動物中心。實驗動物使用許可證號為SYXK(新)2015-0002。飼養(yǎng)、手術、給藥及取材等環(huán)節(jié)均嚴格遵守實驗動物科學與管理的有關規(guī)定。

人參皂苷RH2粉末購自上海順勃生物工程技術有限公司；抗Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)、核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) 和 血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)抗體購于Santa Cruz；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。腦立體定向儀購自廣東省深圳瑞沃德生命科技有限公司；激光多普勒血流儀購自Perimed。

2 實驗方法

2.1MCAO模型的制備和分組 先將實驗動物隨機分為2組：假手術(sham)組18只和手術組40只。MCAO模型的制備采用改良Longa法[9]：術前12 h開始禁食，麻醉后將大鼠以仰臥位固定，備皮并沿頸部正中線切開皮膚，鈍性分離相關肌群后暴露右側頸總、頸內(nèi)及頸外動脈，結扎頸外動脈及頸總動脈近心端，后將線拴沿頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈，推進約18 mm后固定，縫合皮膚即可。假手術組僅在頸部正中縱行剖開后縫合。麻醉清醒后以大鼠前爪不能充分伸展或不能正常行走或行走時出現(xiàn)追尾癥則視為造模成功。最終手術組造模成功38只，依據(jù)Longa 5級評分標準和體重標準納入36只，并隨機分為模型(MCAO)組和實驗(GS-RH2)組，每組18只。術后GS-RH2組灌服人參皂苷RH2(20 mg·kg-1·d-1)，MCAO組和sham組灌服等量的生理鹽水，連續(xù)用藥7 d。

2.2神經(jīng)功能評分 3組動物分別于干預第1、3和7天時進行神經(jīng)功能評分。評分標準如下[10]：無神經(jīng)功能損傷癥狀記為0分；垂直提起時損傷對側前爪不能伸直記為1分；行走時出現(xiàn)追尾癥記為2分；行走時身體向左側跌倒記為3分；不能自發(fā)行走或出現(xiàn)意識障礙記為4分。同時觀察并記錄大鼠的一般生存狀態(tài)。

2.3腦梗死體積的測量 采用TTC法測定腦梗死體積。干預結束時，將各組大鼠麻醉后，斷頭取腦組織，速凍后以前囟為基點做連續(xù)冠狀面切片，切片厚度為2 mm。然后將腦組織切片置于1% TTC溶液中， 37 ℃避光染色30 min。隨后置于4%多聚甲醛溶液中固定17 h。顯微鏡下觀察并計算腦梗死體積。

2.4微血管密度(microvessel density, MVD)的測定 采用免疫組化染色法測定微血管密度。具體操作方法參照SP試劑盒(購自北京中杉金橋生物有限公司)說明書進行。CD34多克隆抗體購自北京中杉金橋生物有限公司，PBS替代 I 抗作為陰性對照(negative control，Neg)。

CD34蛋白表達于微血管內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇中，MVD計數(shù)參考Weidner等[11]報道的方法，經(jīng)CD34陽性染色定位后，由2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師隨機雙盲于低倍鏡下觀察切片，確定血管最多的區(qū)域，然后用高倍鏡計數(shù)每個區(qū)域的微血管數(shù)目。每個切片計數(shù)5個高倍視野的微血管數(shù)，取平均值作為該樣本的MVD值。

2.5MDA含量及SOD和GSH-Px活性的檢測 各組大鼠腦組織樣本經(jīng)相應處理后，依據(jù)南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測說明書檢測MDA含量及SOD和GSH-Px的活性。

2.6Western blot檢測蛋白表達水平 取各組大鼠腦組織加適量裂解液后用勻漿器勻漿， 離心取上清即可得到各組蛋白樣品， 采用BCA試劑盒進行定量分析，調(diào)整各組蛋白上樣量至60 μg，并加入4倍體積的上樣緩沖液，98 ℃水浴變性5 min。而后上樣并進行8% SDS-PAGE，將蛋白電轉至PVDF膜(約90 min)，加5%脫脂牛奶室溫封閉120 min。加入相應的 I 抗，4 ℃孵育過夜，復溫后加TBST洗滌3次，每次5 min；再加入相應的HRP標記的 II 抗，室溫孵育90 min，加TBST洗滌3次，每次10 min。于暗室中將HRP-ECL發(fā)光液灑在PVDF膜的蛋白面上激發(fā)熒光，經(jīng)壓片、顯影及定影后對所得的蛋白條帶行灰度分析。以GAPDH為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)均錄入SPSS 13.0統(tǒng)計學分析軟件中進行統(tǒng)計學分析。實驗結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計量資料行t檢驗，計數(shù)資料行卡方檢驗或校正卡方檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進行均數(shù)組間的兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學顯著性。

結 果

1 一般狀態(tài)分析

術后第1天，各手術組大鼠精神明顯萎靡，反應遲鈍，皮毛發(fā)暗，飲食飲水減少。術后第3～4天，各手術組大鼠活動度依然較差，飲食飲水量少；但與模型組相比， GS-RH2組大鼠精神狀態(tài)有所好轉。至第7天，GS-RH2實驗組大鼠精神狀態(tài)明顯好轉，活動自如，但仍比假手術組差。假手術組大鼠實驗過程中整體狀態(tài)良好。

神經(jīng)功能評分結果顯示：模型組各時間點測得神經(jīng)功能評分均高于假手術組(P<0.05)，說明模型組大鼠已出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損；相較于模型組，給予GS-RH2干預3 d及7 d則可顯著降低神經(jīng)功能評分(P<0.05)，見表1。

表1GS-RH2對MCAO大鼠神經(jīng)功能及腦梗死體積的影響

Table 1. The effect of GS-RH2 on the neurological function and infarction volume of MCAO rats(Mean±SD.n=6)

GroupTreatmenttime(d)NeurologicalfunctionscoreInfrarctionvolume(mm3)Sham100300700MCAO12.45±0.42*59.78±3.79*32.03±0.41*56.62±3.50*72.01±0.42*54.34±3.37*GS-RH212.47±0.3958.47±3.6131.51±0.26﹟47.56±3.24﹟71.42±0.24﹟36.24±3.21﹟

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

TTC法腦梗死體積測定結果顯示:假手術組并未出現(xiàn)梗死灶；而術后模型組及實驗組均出現(xiàn)不同程度的腦梗死；給予GS-RH2干預3 d及7 d所測得腦梗死體積顯著小于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1. The effect of GS-RH2 on the infarction volume of MCAO rats detected by TTC assay.

圖1GS-RH2對MCAO大鼠腦梗死體積的影響

2 微血管密度分析

免疫組化結果顯示，隨生存時間的延長，假手術組MVD值基本無變化。手術后第1天模型組MVD值與假手術組無顯著差異，第3天時顯著上升，但隨生存時間的延長，MVD值呈現(xiàn)下降的趨勢。GS-RH2組MVD值隨生存時間的延長呈上升趨勢，且干預7 d時所測得MVD值顯著高于模型組(P<0.05)。結果提示GS-RH2可促進MCAO大鼠血管新生，見圖2、表2。

Figure 2. The effect of GS-RH2 on the microvessel density of MCAO rats detected by immunohistochemical staining (×400).

圖2免疫組化法測定GS-RH2對MCAO大鼠微血管密度的影響

表2GS-RH2對MCAO大鼠微血管密度的影響

Table 2. The effect of GS-RH2 on the microvessel density of MCAO rats (Mean±SD.n=6)

GroupTimeafterGS-RH2treatment1d3d7dSham14.52±2.0713.42±1.9813.58±2.01MCAO14.75±2.1420.51±2.34*16.33±2.72GS-RH214.69±2.1123.26±2.6424.73±2.67﹟

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

3 腦組織氧化應激狀態(tài)分析

MDA含量分析結果顯示，各時間點模型組的MDA含量均顯著高于假手術組，且隨生存時間的延長，模型組MDA含量呈輕度下降的趨勢；給予GS-RH2干預7 d可顯著降低腦組織中MDA的含量(P<0.05)。SOD及GSH-Px的活性分析結果顯示，各時間點模型組的SOD及GSH-Px的活性均顯著低于假手術組，且隨生存時間的延長，模型組SOD及GSH-Px的活性呈輕度上升的趨勢；給予GS-RH2干預7 d可顯著增加腦組織中SOD及GSH-Px的活性。結果提示GS-RH2可改善MCAO大鼠腦組織的氧化應激狀態(tài)，見圖3。

Figure 3. The effect of GS-RH2 on oxidative stress of MCAO rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

圖3GS-RH2對MCAO大鼠氧化應激水平的影響

4 腦組織Keap1/Nrf2信號通路的活性分析

為進一步探討GS-RH2調(diào)節(jié)MCAO大鼠腦組織氧化應激水平的作用機制，我們于實驗結束即干預7 d時，取部分腦組織分析了Keap1/Nrf2信號通路的活性。Western blot 的結果顯示，假手術組大鼠腦組織中有Keap1、Nrf2及HO-1的基礎表達；損傷7 d時，模型組大鼠腦組織中Keap1蛋白表達減少，Nrf2及HO-1的蛋白表達水平升高(P<0.05)；相較于模型組，GS-RH2干預可使各蛋白表達的變化趨勢更顯著(P<0.05)。結果提示GS-RH2可激活Keap1/Nrf2信號通路，見圖4。

討 論

線栓法構建的局灶性腦缺血模型是目前研究腦缺血性疾病的公認理想模型，本實驗中我們采用SD大鼠建立線栓法MCAO模型，經(jīng)神經(jīng)功能評分及腦梗死體積評定確認模型構建成功，并用于后續(xù)實驗。腦缺血性損傷后，血管新生是改善局部血流供應及損傷修復的關鍵環(huán)節(jié)?；趥鹘y(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展及其在復雜疾病診療上的優(yōu)勢，本研究選取人參皂苷RH2這一活性成分，分析了其在MCAO大鼠血管新生中的作用。

Figure 4. The effect of GS-RH2 on Keap1/Nrf2 signaling pathway of MCAO rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

圖4GS-RH2對MCAO大鼠Keap1/Nrf2信號通路的影響

實驗結果顯示，與模型組相比，給予人參皂苷RH2干預7 d之后，實驗組動物神經(jīng)行為癥狀得到明顯改善，腦梗死體積顯著減小，神經(jīng)功能評分顯著降低。結果表明人參皂苷RH2可顯著改善MCAO大鼠腦缺血所致神經(jīng)損傷。接著我們通過測定微血管密度來評價人參皂苷RH2對MCAO大鼠血管新生的影響，結果顯示， 與模型組相比，給予人參皂苷RH2干預可顯著升高MVD值，表明人生皂苷RH2可促進MCAO大鼠血管新生。

腦組織代謝旺盛，耗氧量極高，局部缺血易致脂質過氧化的發(fā)生，這也是缺血后腦損傷一個重要原因。早期在研究人參皂苷RH2對血管內(nèi)皮的保護作用時發(fā)現(xiàn)，應用人參皂苷RH2可降低血清中MDA的含量，同時提高SOD的活性，具有抗脂質過氧化的作用[9]。故而我們進一步檢測了該過程中MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性，以評價人參皂苷RH2在調(diào)控MCAO大鼠血管新生的過程中是否涉及到氧化應激狀態(tài)的改變。結果顯示， 相較于模型組，給予人參皂苷RH2干預7 d可顯著增加腦組織中SOD及GSH-Px的活性，并降低MDA的含量。這一結果表明人生皂苷RH2可改善MCAO大鼠腦組織的氧化應激狀態(tài)。機體中Nrf2是抗氧化應激反應的重要轉錄因子[12-13]。研究表明，靜息態(tài)下，Nrf2與Keap1結合而處于失活態(tài)，并可通過泛素-蛋白酶體途徑迅速降解；在接受相關信號刺激后，Nrf2則從Keap1上解離、轉位后進入細胞核，調(diào)控一系列抗氧化酶的表達[12, 14-15]；其中血紅素加氧酶則是與神經(jīng)細胞保護作用關系密切的酶系[16-18]。故而我們進一步分析了人參皂苷RH2對Keap1、 Nrf2和HO-1表達的影響，結果顯示，相較于模型組，給予人參皂苷RH2可顯著減少大鼠腦組織中Keap1蛋白的表達，而促進Nrf2及HO-1的蛋白表達， 提示Keap1/Nrf2抗氧化信號通路可能參與了人生皂苷RH2調(diào)控MCAO大鼠血管新生的過程，至于其上下游涉及的其它信號分子及通路還需進一步的實驗驗證。

綜上所述，人參皂苷RH2可促進MCAO大鼠血管新生，其作用機制可能與激活Keap1/Nrf2信號通路，提高抗氧化酶的活性從而抑制氧化應激反應有關。

[1] Zhu L, He D, Han L, et al. Stroke research in China over the past decade: analysis of NSFC funding[J]. Transl Stroke Res, 2015, 6(4):253-256.

[2] Makin SD, Doubal FN, Dennis MS, et al. Clinically confirmed stroke with negative diffusion-weighted imaging magnetic resonance imaging: longitudinal study of clinical outcomes, stroke recurrence, and systematic review[J]. Stroke, 2015, 46(11):3142-3148.

[3] Rostamian S, Mahinrad S, Stijnen T, et al. Cognitive impairment and risk of stroke: a systematic review and meta-analysis of prospective cohort studies[J]. Stroke, 2014, 45(5):1342-1348.

[4] Hui Z, Sha DJ, Wang SL, et al. Panaxatriol saponins promotes angiogenesis and enhances cerebral perfusion after ischemic stroke in rats[J]. BMC Complement Altern Med, 2017, 17(1):70.

[5] Yang J, Li X, Sun T, et al. Semisynthesis and bioactive evaluation of oxidized products from 20(S)-ginsenoside Rg3, Rh2, protopanaxadiol (PPD) and their 20(R)-epimers as cytotoxic agents[J]. Steroids, 2016, 106:26-34.

[6] Shi Q, Shi X, Zuo G, et al. Anticancer effect of 20(S)-ginsenoside Rh2 on HepG2 liver carcinoma cells: activating GSK-3β and degrading β-catenin[J]. Oncol Rep, 2016, 36(4):2059-2070.

[7] Huang J, Peng K, Wang L, et al. Ginsenoside Rh2 inhibits proliferation and induces apoptosis in human leukemia cells via TNF-α signaling pathway[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2016, 48(8):750-755.

[8] Xia T, Wang J, Wang Y, et al. Inhibition of autophagy potentiates anticancer property of 20(S)-ginsenoside Rh2 by promoting mitochondria-dependent apoptosis in human acute lymphoblastic leukaemia cells[J]. Oncotarget, 2016, 7(19):27336-27349.

[9] 李鳳娥， 孔繁利， 孫 新， 等. 人參二醇組皂苷(PDS)對血脂、血清NO、MDA含量、SOD活力的影響[J]. 中國民康醫(yī)學, 2009, (21):2653-2655, 2657.

[10] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[11] Weidner N. Chapter 14. Measuring intratumoral microvessel density[J]. Methods Enzymol, 2008, 444:305-323.

[12] Lu MC, Ji JA, Jiang ZY, et al. The Keap1-Nrf2-ARE pathway as a potential preventive and therapeutic target: an update[J]. Med Res Rev, 2016, 36(5):924-963.

[13] Chen B, Lu Y, Chen Y, et al. The role of Nrf2 in oxidative stress-induced endothelial injuries[J]. J Endocrinol, 2015, 225(3):R83-R99.

[14] Sandberg M, Patil J, D’Angelo B, et al. NRF2-regulation in brain health and disease: implication of cerebral inflammation[J]. Neuropharmacology, 2014, 79:298-306.

[15] Zhai X, Lin H, Chen Y, et al. Hyperbaric oxygen preconditioning ameliorates hypoxia-ischemia brain damage by activating Nrf2 expressioninvivoandinvitro[J]. Free Radic Res, 2016, 50(4):454-466.

[16] Shu L, Wang C, Wang J, et al. The neuroprotection of hypoxic preconditioning on rat brain against traumatic brain injury by up-regulated transcription factor Nrf2 and HO-1 expression[J]. Neurosci Lett, 2016, 611:74-80.

[17] Gao Y, Xu X, Chang S, et al. Totarol prevents neuronal injuryinvitroand ameliorates brain ischemic stroke: potential roles of Akt activation and HO-1 induction[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2015, 289(2):142-154.

[18] Yoo SJ, Nakra NK, Ronnett GV, et al. Protective effects of inducible HO-1 on oxygen toxicity in rat brain endothe-lial microvessel cells[J]. Endocrinol Metab (Seoul), 2014, 29(3):356-362.